1 Основы молекулярной генетики
Ген – единица наследственности, определяющая развитие какого-либо признака организма (1909) Ген – неделимая единица мутации, рекомбинации и функции (середина 20-х годов ХХ века) 50-е годы ХХ века – сформировано важнейшее положение биохимической генетики «Один ген – один фермент» 1957 год – гипотеза «Один ген – один фермент» уточнена – «Один ген одна полипептидная цепь» 2
Современное представление о структуре гена, его функционировании, регуляции его активности складывалось во 2-й половине XX столетия: открыта двухспиральная структура ДНК выделена РНК и выяснена ее роль в передаче наследственной информации от ДНК к белку расшифрован генетический код показана дробимость гена при рекомбинации и мутации 3
Единицу рекомбинации назвали реконом, а единицу мутации – мутоном, однако в дальнейшем было показано, что и мутон и рекон соответствует одной паре нуклеотидов Единицу генетической функции назвали цистроном, что совпадает с первоначальным понятием «ген» В настоящее время термин «цистрон» употребляется достаточно редко как синоним понятия гена в тех случаях, когда хотят подчеркнуть его функциональное значение 4
В современной генетической литературе нет единого общепринятого определения «ген» В основе одних определений положена структурная организация гена, других – функция в организме, в третьих – ген рассматривается как единица в процессе транскрипции Структурный ген – это участок ДНК (или РНК у некоторых вирусов), определяющий линейную последовательность полипептидной цепи или одной молекулы тРНК или рРНК 5
одно- и двух цепочечные ДНК, двух цепочечные РНК, одно- цепочечные РНК с « плюс-цепью » и с « минус-цепью » наличие перекрывающихся генов (ген в гене) – имеются различные рамки считывания с одной и той же нуклеотидной последовательности 6
Гены объединены в группы или кластеры – все сцепленные гены кластера кодируют ферменты одного биосинтетического пути и транскрибируются на общую молекулу мРНК – полицистронную мРНК Группа структурных генов прокариот, находящихся под контролем одного регуляторного участка, называют опероном Между оперонами располагаются межгенные участки – спейсеры 7
8
В геноме эукариот выделяют три типа последовательностей ДНК: Уникальные последовательности – представлены одной или несколькими копиями (60-80% генома). Умеренные повторы – от десятка до нескольких тысяч копий на геном (10-20% генома) Высокоповторяющаяся ДНК – от нескольких тысяч до миллиона копий на геном (10-20% генома) 9
Большинство функционирующих генов являются уникальными последовательностями, некоторые представлены умеренными повторами Высокоповторная ДНК представлена очень короткими последовательностями (около 300 п.н.) – вероятно играет структурную или регуляторную роль и локализована в основном в прицентромерном гетерохроматине 10
Большинство эукариотических генов имеет «мозаичную» экзон-интронную структуру Экзоны – участки гена, кодирующие структуру полипептида Интроны – участки гена, не кодирующие структуру полипептида 11
Количество интрон-экзонных переходов в пределах гена может варьироваться от 0 до 50 Колебание размеров более характерно для интронов – от 20 до более чем 10000 п.н. Роль интронов до конца не ясна, вероятно они участвуют в процессах генетической рекомбинации, а также в процессах регуляции экспрессии 12
Кроме того, выделяют: Промоторы – участки присоединения РНК полимеразы Энхансеры – усилители транскрипции Сайленсеры – ослабители транскрипции Между генами существуют межгенные последовательности – спейсеры 13
1 – энхансеры ; 2 – сайленсеры ; 3 – промотор; 4 – экзоны ; 5 – интроны ; 6 – участки экзонов, кодирующие нетранслируемые области 14 1 2 3 6 4 5 4 5 4 5 4 6 1 2
Экспрессия генов – реализация генетической информация, выражающаяся в процессах транскрипции и трансляции Транскрипция – процесс переноса генетической информации с ДНК на РНК Трансляция – биосинтез полипептидной цепи белка на матрице мРНК 15
Матрицей для синтеза РНК служит только одна из двух цепей ДНК, так называемая смысловая цепь (3’ → 5’) Транскрипция происходит не на всей молекуле ДНК, а только на участке одного гена Помимо структурных генов (несущих информацию о структуре белков), имеются гены, кодирующие рРНК и тРНК 16
Инициация Элонгация Терминация 17
Инициация – начало синтеза К промотору присоединяется комплекс ферментов, включая ДНК-зависимую РНК-полимеразу Присоединение к промотору инициирует раскручивание двойной цепочки ДНК и разрыв нуклеотидных связей 18
Элонгация – последовательное присоединение свободных нуклеотидов к «смысловой цепи» ДНК по принципу комплементарности (А-У, Г-Ц) и соединение их в полирибонуклеотидную цепь при помощи РНК-полимеразы 19
Терминация – завершение синтеза РНК в участке терминаторе, который узнается РНК-полимеразой при участии регуляторных белковых факторов терминации 20
При экспрессии генов, кодирующих структуру белка, образуется гетерогенная ядерная РНК ( гяРНК ) или пре-мРНК, которая копирует всю нуклеотидную последовательность ДНК от промотора до терминатора, включая нетранслируемые области Эта гяРНК подвергается созреванию – процессингу 21
Процессинг – процесс образования функционально активных мРНК 1) участки РНК, транскрибированные с интронов, вырезаются, а участки РНК, транскрибированные с экзонов – сшиваются – сплайсинг 2) к 5’-концу гяРНК присоединяется 7-метил-ГТФ – кэпирование (« кэп » - шапочка) 3) к 3’-концу присоединяется полиадениловый участок размером в 100-250 нуклеотидов – полиаденилирование 22
Обычно гяРНК в несколько (иногда в десятки) раз больше мРНК - если гяРНК составляет примерно 10% генома, то мРНК – только1-2% Функции « кэпа » заключаются в прикреплении мРНК к рибосоме и инициации процесса трансляции – синтеза белка Функции полиаденилового хвоста – защита мРНК от ферментативного разрушения во время транспортировки к рибосомам 23
Структура гяРНК : 1 – 5’-нетранслируемая область; 2 - 3’-нетранслируемая область»; 3 – копии экзонов ; 4 – копии интронов 24 1 3 4 3 4 3 4 3 2 Структура мРНК : 1 – « кэп »; 2 – полиадениловый участок; 3 – копии экзонов 1 3 3 3 3 2
Термин " сплайсинг " происходит от английского слова splice - соединять встык Макромолекулярный комплекс, называемый сплайсосомой, вырезает интроны и сшивает вместе экзоны В состав сплайсосомы входят пять рибонуклеопротеинов, которые обозначают U1, U2, U4, U5 и U6, образованные молекулами малой ядерной РНК ( мяРНК ) и белками 25
Наряду с последовательным вырезанием интронов существует т.н. альтернативный сплайсинг При альтернативном сплайсинге удаляются не только интроны, но и некоторые экзоны В результате получается отличающийся вариант мРНК, на основе которой в рибосоме синтезируется другой белок 26
Открытие альтернативного сплайсинга вновь заставляет модифицировать правило «Один ген - одна полипептидная цепь», так как с одного гена может получаться несколько различающихся полипептидных цепей Пример альтернативного сплайсинга у человека: ген структурного белка тропомиозина дает начало пяти разным вариантам этого белка в разных тканях организма: скелетной мышце, гладкой мышце, фибробластах, печени и мозге 27
28
Регуляция экспрессии генов определяет: Согласованное действие всех элементов генома Определение времени активации/репрессии генов Экспрессия генов может регулироваться как на уровне транскрипции, так и посредством посттранскрипционных процессов, включая трансляцию 29
Практически полностью осуществляется на уровне транскрипции Единицей транскрипции генов у прокариот является оперон Оперон включает в себя: - промотор – участок присоединения РНК-полимеразы - оператор – участок присоединения белка-регулятора - терминатор – участок окончания синтеза генов оперона - ген-регулятор – кодирует белок регулятор 30 Р П О С 1 С 2 С 3 Т
Негативная регуляция – связывание регуляторного белка с оператором репрессирует работу оперона Позитивная регуляция – связывание регуляторного белка с оператором активирует оперон Кроме того известны вещества – индукторы и репрессоры, которые также могут влиять на регуляторный белок (репрессировать или стимулировать) 31
32 Специфическая регуляция проявляется в активации или инактивации транскрипции с отдельных генов с участием промоторов, энхансеров и сайленсеров Промоторы – участки длиной 30-60 п.н., для связывания с ДНК факторов транскрипции, образования комплекса ДНК-РНК полимеразы для запуска синтеза РНК
33 Энхансеры – усилители транскрипции: Могут находится как в концевых областях, так и в интронах и даже на значительных расстояниях от промоторов Активируют гены независимо от ориентации Один энхансер может активировать различные гены Действие их может быть ткане - и видоспецифичным Энхансеры доступны действию различных белков, в том числе и гормонов Сайленсеры – ослабители транскрипции, могут оказывать действие на большом расстоянии от гена
34 Одна и та же последовательность ДНК может выступать и в роли энхансера, и в роли сайленсера в зависимости от типа клеток Эти участки представляют собой короткие участки ДНК (100-200 п.н.), являющиеся местом прикрепления регуляторных белков Взаимодействие регуляторных протеинов с этими участками изменяет активность генов вследствие изменения конформации определенного участка ДНК
35 Метилирование оснований ДНК может служить одним из факторов регуляции экспрессии генов у эукариот Неактивные гены содержат относительно много метильных групп Механизм действия метильных групп заключается в том, что они нарушают взаимодействия ДНК – белок
36 Неспецифическая регуляция экспрессии Регуляция транскрипции может осуществляться также путем конденсации-деконденсации хроматина Регуляция экспрессии происходит на уровне процессинга – феномен альтернатиного сплайсинга Контроль на уровне транспортировки РНК – примерно половина гя-РНК полностью распадается в ядре, не выходя за его пределы
37 Неспецифическая регуляция экспрессии Контроль на уровне стабилизации м-РНК – избирательная стабилизация определенных типов м-РНК в цитоплазме, которые не подвергаются распаду после трансляции Контроль на уровне трансляции – отбор определенных м-РНК для трансляции на рибосомах Контроль на уровне пострансляционной модификации белка
