Лекция
Ферменты – биологические катализаторы. Отличительные признаки ферментативного и химического катализа. Специфичность Природа катализа, теории ферментативного катализа Классификация и номенклатура ферментов Строение ферментов (активный и аллостерический центры) Коферменты и кофакторы. Роль витаминов Кинетика ферментативных реакций Ингибирование ферментативных реакций Регуляция активности ферментов Принципы энзимодиагностики Применение ферментов в медицине
Катализаторы – это вещества, которые влияют на скорость химической реакции, но сами при этом не расходуются. Ферменты, или энзимы, - это биологические катализаторы, образующиеся и функционирующие во всех живых организмах. По своему химическому строению почти все ферменты являются белками. Каталитически активные рибонуклеиновые кислоты называются рибозимами
1) не входят в состав конечных продуктов реакции и не тратятся в процессе катализа, выходят из реакции в неизменном виде. 2) ускоряют реакции, не противоречащие законам термодинамики. 3) не смещают положение равновесия, а лишь ускоряют его достижение.
Скорость ферментативного катализа выше, чем небиологического. Ферменты обладают узкой избирательностью – специфичностью, действия на субстраты. 3) Ферментативные процессы не дают побочных реакций, для них характерен 100% выход продукта. 4) Ферменты катализируют реакции в мягких условиях : при обычном давлении, небольшой температуре и значениях рН, близких к нейтральным. 5) Активность ферментов регулируется – они могут изменять свою скорость под воздействием ряда факторов, обеспечивая скоординированность всех метаболических процессов во времени.
Под субстратной специфичностью понимают способность фермента взаимодействовать с одним или несколькими определенными субстратами Различают: абсолютн ую специфичность ( глюкокиназа ) относительн ую (или группов ую ) специфичность ( пепсин ) c тереохимическ ую специфичность : например, глюкозооксидаза окисляет только β - D -глюкозу
Процесс катализа можно представить следующим уравнением : E + S ⇆ [E S ] → [E Р ] → E + P Стадии ферментативной реакции : Сближение фермента и субстрата: E + S Стабилизация переходного состояния: [E S ] Каталитическая реакция – превращение субстрата в продукт реакции – [E Р ] → E + P
Катализ приводит к ускорению достижения равновесия за счет снижения энергии активации (Е а ), часто ступенчато.
В реакцию вступают молекулы, преодолевшие энергетический барьер и обладающие энергией активации Е а В переходном состоянии [ ES ] происходит перераспределение химических связей и образование продуктов реакции. Природа ферментативного катализа состоит в том, что ферменты с термодинамической точки зрения ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации. Энергия активации – это та минимальная энергия, которая необходима для того, чтобы произошла химическая реакция, т.е. энергетический барьер преодолевают молекулы, обладающие энергии активации
Образование фермент-субстратного комплекса согласно теории Э. Фишера «ключ-замок». Изменения структуры активного центра фермента, вызванныесубстратом, согласно модели «индуцированного соответствия» Д. Кошланда. Доказано рентгеноструктурным анализом, ЭПР и ЯМР
Индуцированное соответствие при функционировании гексокиназы (подтвеождение гипотезы Д. Кошланда)
Оксидоредуктазы Трансферазы Гидролазы Лиазы Изомеразы Лигазы
В соответствии с классификацией ферментов каждый фермент получил систематической название : название субстратов (через двоеточие), название типа химического превращения и окончания -аза). Например, лактатдегидрогеназа будет иметь систематическое название «L-лактат:NAD + оксидоредуктаза» На практике используют рабочие названия ферментов, которые состоят из названия субстрата, типа реакции и окончания «-аза». Например: ЛАКТАТ + ДЕГИДРОГЕНизация + АЗА = ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА. Некоторые ферменты сохранили исторически сложившиеся тривиальные названия, например УРЕАЗА, ПЕПСИН
катализируют реакции окисления-восстановления: Лактатдегидрогеназа (LDH, EC 1.1.1.27) катализирует превращение молочной кислоты (лактат) в пировиноградную (пируват) и наоборот: СН 3 СН(ОН)СООН + NAD + ↔ CH 3 COCООH + NAD H + H +
Катализируют реакции переноса групп с одной молекулы на другую Холинацетилтрансфераза, ЕС 2.3.1.6, (систематическое название ацетил-КоА: холин О-ацетилтрансфераза ) СH 3 CO -S-KoA + HO-СН 2 -СН 2 -N + (CН 3 ) 3 → КоА-S H + СН 3 СО O-СН 2 -СН 2 -N + (CН 3 ) 3
Катализируют реакции разрыва связей с присоединением воды Дипептидаза расщепляет дипептид на две аминокислоты при участии воды: H 2 N-CH(R)-CO - NH-CH(R')-COOH + H 2 O → H 2 N-CH(R)-CO OH + NH 2 -CH(R')-COOH
Катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления): Пируватдекарбоксилаза (ЕС 4.1.1.1, 2-кетокислоты карбокси-лиаза ) катализирует расщепление пирувата до уксусного альдегида с отщеплением СО 2 : CH 3 COCООH → CH 3 COH + СО 2
Катализируют реакции, связанные с изменением строения внутри одной молекулы Глюкозо-6-фосфат-изомераза (ЕС 5.3.1.9, D-глюкозо-6-фосфат кето-изомераза ) превращает глюкозо-6-фосфат во фруктозо-6-фосфат и наоборот:
Катализируют реакции присоединения с образованием ковалентной связи. Реакции ферментов этого класса необратимы и протекают с использованием энергии АТФ. Аспартат-синтетаза ( ЕС 6.3.1.1, L-аспартат: аммиак-лигаза синтезирует аспарагин из аспарагиновой кислоты и аммиака:
По классификации ферментов (КФ- русскоязычная, ЕС-англоязычная) каждый фермент (энзим) имеет свой определенный код, состоящий из четырех цифр, разделенных точками. Первая цифра обозначает класс фермента, вторая – подкласс, третья – подподкласс, четвертая означает номер фермента.
Внутри каждого класса происходит разделение на подклассы : EC 1.1 Действующие на CH-OH группы донора EC 1.2 Действующие на альдегидные или оксо- группы донора EC 1.3 Действующие на CH-СH группы донора EC 1.4 Действующие на CH-NH 2 группы донора EC 1.5 Действующие на CH-NH группы донора Фермент Лактатдегидрогеназа (LDH, EC 1.1.1.27) – это оксидоредуктаза окисляет гидроксильную группу в молекуле лактата, поэтому относится к 1 подклассу: СН 3 СН(ОН) СООН + NAD + → CH 3 CO CООH + NAD H + H +
Внутри каждого подкласса происходит разделение на подподклассы: EC 1. 1. 1 Акцептор NAD или NADP EC 1.1.2 Акцептор- цитохром EC 1.1.3 Акцептор- кислород EC 1.1.4 Акцептор- сульфид EC 1.1.5 Акцептор- хинон или подобная группировка Коферментом Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1.1. 1.27) является НАД, поэтому этот фермент относится к 1 подподклассу: СН 3 СН(ОН) СООН + NAD + → CH 3 CO CООH + NAD H + H +
Последнее число – номер конкретного фермента: EC 1. 1. 1. 1 alcohol dehydrogenase EC 1.1.1. 2 alcohol dehydrogenase (NADP + ) EC 1.1.1. 3 homoserine dehydrogenase EC 1.1.1. 4 (R,R)-butanediol dehydrogenase ... и т. д. У Лактатдегидрогеназы (LDH, EC 1. 1. 1. 27 ) 27 порядковый номер в ряду ферментов 1 подподкласса СН 3 СН(ОН) СООН + NAD + → CH 3 CO CООH + NAD H + H +
По своему химическому строению почти все ферменты являются белками Активный центр располагается в углублении (в нише) третичной конформации поверхности фермента Рис. Субстрат-связывающий карман в сериновых протеазах.
Активный центр фермента – это уникальная комбинация аминокислот, благодаря которой осуществляется его каталитическое действие. В активном центре выделяют 2 домена : « контактный », в котором происходит связывание и ориентация субстрата, и « каталитический », в котором происходит химическое превращение субстрата Эти 2 домена могут перекрываться У простых белков-ферментов активный центр образован радикалами аминокислот У сложных белков-ферментов в активном центре находятся коферменты или кофакторы
Контактная («якорная) площадка обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В Каталитическом домене происходит химическое превращение субстрата Молекула субстрата также содержит функционально различные участки, подвергающиеся атаке со стороны фермента.
В образовании фермент-субстратных комплексов участвуют водородные, электростатические (ионные) и гидрофобные взаимодействия, а также координационные связи Информация о природе связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии
Активный центр в сериновых протеазах. В каталитическом домене активного центра выделены Ser195 (оранжевый), His57 (синий) и Asp102 (малиновый), в субстрат-связывающем домене зеленым изображены NH-группы, образующие оксианионовую дыру, голубым — неспецифическая субстрат-связывающая площадка, и желтым - группы, выстилающие специфический субстрат- связывающий карман. Гидрофобные и ионные взаимодействия водородные взаимодействия
Аллостерический центр («Аллос» – другой, « Steros » - пространственный), расположенный вдали от активного центра, специальный регуляторный центр фермента, с которым связываются низкомолекулярные вещества – эффекторы, молекулы которых отличаются по структуре от субстратов. Положительный эффектор ускоряет реакцию Отрицательный эффектор замедляет реакцию Ферменты, имеющие аллостерический центр, получили название аллостерических ферментов.
Аллостерические взаимодействия играют важнейшую роль в контролировании и интегрировании биохимических реакций. Менее активная конформация называется Т- c остояние (от английского tense – напряженное), а более активная – R- состояние ( от английского relaxed – расслабленное).
Если молекула фермента состоит из белковой части (полипептидная нить) и небелковой части, то это сложные ферменты. Белковая часть фермента, называется апоферментом Небелковая часть сложного фермента, называется КОФЕРМЕНТОМ или кофактором Если КОФЕРМЕНТ прочно связан с апоферментом, его называют ПРОСТЕТИЧЕСКОЙ ГРУППОй Природный комплекс апофермента с кофактором составляет ХОЛОФЕРМЕНТ, т. е. функционально действенный энзим. Соединение в ХОЛОФЕРМЕНТ осуществляется любыми типами связей, кроме ковалентных. Апофермент синтезируется в организме Большинство коферментов – это производные витаминов или содержат витамин в качестве компонента
Структура цитохрома Р450 Активный центр простетическая группа Апофермент
Кофермент – термостабильное низкомолекулярное соединение, небелковая часть сложных белков-ферментов, без которых фермент не активен Кофакторы - ионы некоторых металлов (Mg, Zn, Fe, Сu, Со, Mo и др.), прочно связанные с активным центром Роль кофакторов – улучшение образования [ES] -комплекса, ориентация субстрата, стабилизация как субстрата, так и активного центра фермента
Участие в акте катализа Осуществление связи между ферментом и субстратом Стабилизация апофермента Апофермент усиливает каталитическую активность небелковой части (КФ и ПГ). Например, NAD + является КФ многих дегидрогеназ, отличие - в апоферментной части.
К коферментам относят следующие соединения: Производные витаминов Гемы, являющиеся простетической группой цитохромов, каталазы, пероксидазы Нуклеотиды – доноры и акцепторы остатка Н 3 РО 4 Убихинон, или ко Q ФАФС – фосфоаденозилфосфосульфат донор сульфата SAM – S -аденозилметионин донор метильной группы Глутатион
Витамин кофермент Фермент и функция кофермента Никотиновая кислота витамин РР NAD +, NADF + Оксидоредуктазы Перенос Н + ( ē ) Рибофлавин - витамин В 2 FAD, FMN Оксидоредуктазы Перенос Н + ( ē ) Пантотеновая кислота Кофермент А (Коэнзим А) Активация и перенос ацильных групп Биотин Биотин Карбоксилазы Перенос СОО-групп Пиридоксин - витамин В б Пиридоксаль- Фосфат Трансаминазы Перенос аминогрупп Фолиевая кислота Тетрагидрофо - лиевая кислота Перенос одноуглеродных Фрагментов
Изоферменты(изоэнзимы, изозимы) разные структурные формы ферментов, обладающие каталитической активностью одного типа; встречаются у организмов одного вида (или в одной ткани). И. катализируют одну и ту же реакцию, но различаются аминокислотным составом, некоторыми физическими, иммунологическими и каталитическими Лактатдегидрогеназа имеет 5 изоформ; каждая форма (тетрамер) построена из 4 белковых субъединиц двух типов.
Кинетика ферментативных реакций – раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакции от химической природы реагирующих веществ и от факторов окружающей среды Скорость ферментативной реакции определяется изменением количества молекул субстрата или продукта за единицу времени Кинетика ферментативных реакций определяется образованием фермент-субстратного комплекса: E + S ⇆ [ES] → [ES] → E + P
Каталитическая активность ферментов выражается в каталах и международных единицах (МЕ): 1 кат – это количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 сек МЕ фермента – это количество фермента, которое превращает 1 мкмоль субстрата за 1 мин 1 кат = 6 ∙ 10 7 МЕ или 1МЕ = 16,67 нкат Удельная активность фермента – это количество единиц активности фермента в образце ткани, деленное на массу белка в этой ткани
Полный математический анализ ферментативной реакции приводит к сложным уравнениям, не пригодным для практического применения. Наиболее удобной оказалась модель ферментативной реакции первого порядка (один субстрат), разработанная в 1913 году немецким химиком Леонором Михаэлисом (1875-1949) и канадским патологом Мо Ментеном (1879-1960)
Ферментативный процесс можно выразить следующим уравнением: где k 1 – константа скорости образования [ES] k -1 – константа скорости обратной реакции k 2 – константа скорости образования продукта реакции Соотношение констант скоростей называют константой Михаэлиса К m : k m = (k -1 + k 2 )/k 1 Скорость реакции пропорциональна концентрации [ES] А скорость образования [ES] зависит от концентрации [S] и концентрации [ Е ] Наибольшая скорость реакции наблюдается, когда все молекулы фермента находятся в комплексе с субстратом
Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата выражается следующим уравнением (математическое выведение этой формулы можно найти в пособиях по ферментативной кинетике) V = V max • [S]/(K m +[S]) В этом уравнении V max и K m не зависят от концентрации субстрата и характеризуют свойства фермента – они являются кинетическими характеристиками эффективности фермента V max – дает характеристику каталитической активности фермента, имеет размерность моль/л и определяет максимальную возможность образования продукта при данной концентрации фермента в условиях избытка субстрата K m – характеризует сродство данного фермента к данному субстрату и является постоянной величиной. Константа Михаэлиса измеряется в моль/л и бывает от 10 -2 до 10 -7, чем меньше К m, тем активнее фермент.
График зависимости начальной скорости от концетрации субстрата для аллостерических ферментов имеет сигмоидный характер
При [S] < < k m V = V max • [S]/ k m = k • [S], т.е. при очень низких [S] скорость прямо пропорциональна концентрации субстрата При [S] = k m V = V max • [S]/( • [S]+[S]) = V max /2, т.е. k m равна концентрации субстрата при половине максимальной скорости При [S] > > k m V = V max • [S]/(K m +[S]) = V max • [S]/[S] = V max, т.е. при очень высоких [S] скорость является максимальной и не зависит от [S]
Определение V max затруднительно по асимптоте. Для устранения этого неудобства ЛАЙНУИВЕР и БЭРК приравняли обратные зависимости левой и правой частей уравнения. Это уравнение прямой линии: у = ах + b Графическое выражение для скорости реакции в координатах Лайнуивера-Бэрка имеет вид прямой линии, отсекающей на оси Х значение -1/K m, а на оси Y- значение 1/V max :
Температурный коэффициент Q 10 показывает во сколько раз ускоряется скорость реакции при повышении температуры на 10 0 С При 100 0 С почти все ферменты утрачивают свою активность (исключение составляют, очевидно, только один фермент мышечной ткани - миокиназа, которая выдерживает нагревание до 100 0 С), так как происходит денатурация белка При низких температурах (0 0 С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя активность их падает почти до нуля (снижается кинетическая энергия - Е А ). На термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация субстрата, рН среды и другие факторы.
Кислотность среды особенно важна для аминокислот активного центра: наличие или отсутствие зарядов, т.е. степень ионизации, влияет на образование фермент-субстратного комплекса, на способность фермента к связыванию субстрата.
рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2.0. Влияние изменений рН среды на молекулы фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислотных и основных групп (СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина и др.). При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизированной или в неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратного комплекса. -СООН АСП или ГЛУ при рН < 7 будет нейтральной, а при рН > 7 имеет «-» заряд - NH 2 АРГ, ГИС, ЛИЗ при рН < 7 будет имеет «+» заряд, а при рН > 7 будет нейтральной Кроме того, имеет значение и состояние ионизации субстратов и кофакторов.
Ингибирование Обратимое Необратимое Конкурентное Неконкурентное
Ферменты являются белками, поэтому любые агенты, вызывающие денатурацию белка (кислоты, щелочи, соли тяжелыхи металлов, нагревание), приводят к необратимой инактивации фермента. Необратимое ингибирование неспецифично, оно не связано с механизмами действия ферментов С н еобратимым ингибированием связано действие многих токсинов и ядов на организм.
Специфические ингибиторы вызывают обратимое ингибирование и поддаются количественному изучению на основе уравнения Михаэлиса-Ментен. Обратимое ингибирование в свою очередь разделяют на конкурентное и неконкурентное в зависимости от того, удается или не удается преодолеть торможение ферментативной реакции путем увеличения концентрации субстрата.
При конкурентном ингибировании ингибитор и субстрат конкурируют между собой за место в активном центре, стремясь вытеснить один другого из фермент-субстратного комплекса. Действие конкурентного ингибитора снимается высокими концентрациями субстрата, при этом V max не изменяется, а К m, увеличивается
V max не изменяется, а К m, увеличивается
Прозерин и эндрофоний – ингибиторы холинэстеразы используют при лечении мышечной дистрофии (нейромедиатор ацетилхолин вызывает деполяризацию мембраны) Сульфаниламиды – аналоги пара-аминобензойной кислоты являются антиметаболитами
Неконкурентное ингибирование вызывается веществами, не имеющими структурного сходства с субстратами и часто связывающимися не с активным центром, а в другом месте молекулы фермента Степень торможения определяется продолжительностью действия ингибитора на фермент. Неконкурентное ингибирование может быть обратимым и необратимым, поскольку отсутствует конкуренция между субстратом и ингибитором за активный центр. Примером необратимого ингибирования является действие йодацетата, диэтил-n-нитрофенилфосфата и солей синильной кислоты. Это действие заключается в связывании и выключении функциональных групп или ионов металлов в молекуле фермента
V max уменьшается, а К m не изменяется
Аспирин ингибирует циклооксигеназу
Ковалентная модификация – частичный протеолиз: зимогены - пепсиноген Нековалентная модификация : фосфорилирование-дефосфорилирование – гликогенфосфорилаза (фосфорилированная форма активная, дефосфорилированная – неактивная Ингибирование – регуляция по принципу обратной связи: конечный продукт ингибирует ключевой фермент: холестерин – ГМГКоА-редуктазу Репрессия или индукция генов (изменение биосинтеза ферментов): тироксин взаимодействует с гормончувствительным участком ДНК Компартментализация : ЖК синтезируются в цитоплазме, окисляются в митохондриях (ЦПЭ) Аллостерическая регуляция
Концентрация внутриклеточных (тканевых) ферментов в крови увеличивается при поврежден клеток: АСТ, АЛТ – гепатит; КФК, АСТ, ЛДГ – инфаркт миокарда Количество высвобождаемых ферментов достаточно для его обнаружения: АСТ в норме 2-25 МЕ, при гепатитах – 150-1000 МЕ Активность высвобождаемых ферментов стабильна Органоспецифичность: ЩФ Регана при раке легких
При заболеваниях ЖКТ: мезим-форте, фестал, энзистал, панкреатин При иммунодефицитах: вобэнзим Протеолитические ферменты: трипсин, химотрипсин При тромбозах: урокиназа, стрептолиаза Для рассасывания рубцов ( при ожогах): лидаза (гиалуронидаза )
