Микрофлора играет важную роль в поддержании здоровья на оптимальном уровне. В настоящее время микрофлора рассматривается как метаболически активный орган. Микрофлора и слизистые находятся в тесном взаимодействии, оказывая взаимное влияние
Постоянная часть – облигатная,индигнная, аутохтонная (постоянно входящие в состав нормофлоры и играющие важную роль в метаболизме хозяина). Факультативная часть – транзиторная (часто встречается у здоровых, состав не постоянный).
Создание колонизационной резистентности (КР), механизма, предотвращающего заселение экзогенными микроорганизмами и их избыточный рост. Синтез веществ(органические кислоты, перекись), подавляющих рост экзогенных микробов. Конкуренция за места прикрепления на слизистых и за источники питания. Стимуляция гуморального и клеточного Иммунитета, локального иммунитета
Регуляция газового состава кишечника и других полостей организма. Продукция энзимов, участвующих в в метаболизме белков, жиров, углеводов. Детоксикация экзогенных и эндогенных субстратов и метоболитов (естественный биосорбент). Образование свободных метаболитов желчи
Повышение резистентности эпителиальных клеток к мутагенам (канцерогенам). Морфокинетическая Антимутагенная канцеролитическая Хранилище микробных плазмидных и хромосомных генов Обеспечение цитопротекции.
На протяжении многих лет, со времен Пастера и Коха для исследования микрофлоры применяются классические культуральные методы. Получены фундаментальные данные о составе микрофлоры тела человека Выделены и идентифицированы более 500 видов микроорганизмов В последние годы, проведен мониторинг качественного и количественного изменения по возрастам.
Высокая специфичность, чувствительность, высокая скорость, прямое определение возбудителя Проводится в несколько этапов. Необходимость стадии электрофореза
Для детекции и количественного определения большого количества родов и групп микроорганизмов. используются группоспецифические, подгруппоспецифические праймеры. Группа C. leptum 5 ’ GCACAAGCAGTGGAGT 3’ Видоспецифические праймеры – детекция определенных видов микроорганизмов.
Создание праймера 2-х этапный процесс – «записать » нуклеотидную последовательность и синтез праймера. Определение нуклеотидной последовательности Секвенирование.
В 1999 году группа ученых из (Франция) и Университета Ридинга (Великобритания) применили для исследования микробной популяции кишечника метод секвенирования генов 16S РНК Идеальный маркер для идентификации микроорганизмов ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК. Этот ген есть в геноме всех бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные. Нуклеотидные последовательности 16S РНК всех известных бактерий общедоступны (ген банк).
Только 24% полученных последовательностей 16S РНК принадлежали известным ранее микроорганизмам. Три четверти представителей микрофлоры не культивируются.
Аэробные коринеформные бактерии Corynebacterium – подмышечные впадины,грудная клетка, промежность, кожа носа. Brevibacterium – на руках, стопах ног. Анаэробные коринеформные. Propionibacterium acnes – на крыльях носа, головы спины(сальные железы). На фоне гормональной перестройки играют значительную роль в возникновении юношеских acne vulgaris
Коринеформные – обнаруживают чаще в кожных складках.
Propionibacterium. Облигатно анаэробные грамположительные неспоробразующие. Обнаруживаются в глубоких слоях кожи.
Микрококки Staphylococcus aureus – нос, промежность, подмышечные области. Staphylococcus epidermidis – кожа рук, ног, лба. Micrococcus luteus – в кожных складках, бедрах, чаще в пубертатный период. Анаэробны кокки – Peptosreptococcus – кожа лба.
Стафилококки
Стафилококки – электронная микроскопия
Эпидермальный стафилококк – рост на кровяном агаре без гемолиза.
Микрококки на кровяном агаре колонии, продуцирующие желтый пигмент.
Бациллы- транзиторно
Бациллы гемолиз на кровяном агаре.
Микрофлора наружных слуховых проходов. Коагулозонегативные стафилококки, Коринебактерии. При патологических процессах – Псевдомонады, протеи, эшерихии.
Ротовая полость Стрептококки – Streptococcus salivarius. Стафилококки – S. aureus, S. epidermidis, анаэробные кокки в слюне. Haemophilus inffluenzae – часто у здоровых. Облигатноанаэробные неспорообразующие анаэробы(превотеллы, порфиромонасы) Лактобактерии, лептотрихии. Грибы рода Candida
Стрептококки на кровяном ага-ре.
Стрептококки ( Streptococcus mutans)
Стрептококки – электронная микроскопия.
Гемофильные палочки
Небные миндалины- гемолитические стрептококки( S.pyogenes), S. pneumoniae, анаэробные кокки, H.influenza, неспорообразующие анаэробы. Нос - S. aureus, S. epidermidis, непатогенные нейссерии,иногда коринебактерии. Трахея, бронхиолы, альвеолы-стерильны.
Наличие внешних источников здорового бактериального представительства ( мать и родственники, близко контактирующие с ребенком Грудное вскармливание (противомикробные компоненты грудного молока) Селективное заселение представителей нормальной микрофлоры из множества микроорганизмов окружающей среды.
Противомикробные соединения Иммуноглобины: slgA, SlgG, SlgM Лактоферрин, лактоферрин В и Н Лизоцим Лактопероксидаза Антитела к-казеин и α - лактальбумин Хаптокоррин ( Haptocorrin ) Муцины Лактадхерин ( Lactadherin) Свободный секреторный компонент Олигосахариды и пребиотики Жирные кислоты Материнские лейкоциты и цитокины sCD14 Комплемент и дополнительные рецепторы β - дефензин-1 Бифидофактор Устойчивые/стимулирующие соединения Цитокины II - 10 и TGF β Антиидиотипические антитела Соединения развития иммунитета Макрофаги Нейтрофилы Лимфоциты Цитокины Факторы роста Гормоны Молочные пептиды Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Нуклеотиды Молекулы адгезии Противовоспалительные соединения Цитокины: II-10 и TGF β Антагонист рецептора II-1 TNF α и рецепторы II-6 sCD14 Молекулы адгезии Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Гормоны и факторы роста Остеопротегерин Полиненасыщенные жирные кислоты с длинной цепью Гормоны и факторы роста Соединения с иммунологическими свойствами в грудном молоке
Кишечник-часть иммунной системы. В реализации иммунных механизмов на уровне интестинального тракта принимают участие три ключевых и одновременно взаимосвязанных компонента: Нормальная микрофлора. Лимфоидная ткань, ассоциированная со слизистой оболочкой кишечника Цитокины, как фактор межклеточного взаимодействия.
Использование молекулярно-генетических методов коренным образом изменило наши представления о составе микрофлоры Интестинальная микрофлора представлена преимущественно облигатно анаэробными группами микроорганизмов Большинство видов микроорганизмов относится к некультивируемым микроорганизмам
1 доминирующая группа до 43% Clostridium coccoides group Clostridium, Eubacterium, Ruminococcus, Coprococcus, Dorea, Lachnospira, Roseburia and Butyrivibrio 2- доминирующая Clostridium leptum группа 19-25% Anaerqfilum Clostridium,Eubacterium,Ruminococcus 3- группа Cytophaga-Flavobacter-Bacteroides 1- минорная группа Bifidobacterium около 5-10% 2 – минорная группа Lactobadllus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus Leuconostoc
Бифидобактерии облигатная флора детей раннего возраста. К концу 2 недели жизни обнаружены у 40-60% новорожденных. Доминируют у 96%-100% клинически здоровых детей, на грудном вскармливании, у 75% на искусственном. У взрослых бифидобактерии составляют менее 10% микробиоты. Их присутствие жизненно важно. Важнейшая функция создание КР, препятствуют транслокации условнопатогенных из кишечника. Концентрация 109-1010 мт От 1до 4 видов бифидобактерий B. longum, B. adolescentis, B. breve, B. pseudocatenulatum
Лактобактерии..Облигатная флора.К концу 1-го месяца жизни обнаружены у 57%детей, находящихся на грудном вскармливании В мере взросления их количество увеличива-лось. Содержание в большей степени зависит от вводимых кисломо-лочных продуктов. Количество 106 –108 в 1 г.
Бактероиды. Неспоробразующие грамотрицательные анаэробы. Способны отщеплять остатки фукозы от поверхности клеток хозяина используя в качестве источника энергии или как строительный материал для синтеза различных молекул, включая богатые фукозой капсулы В 8 месяцев –80% В 10 месяцев у 100%. Высокочувствительны к действию кислорода, необходимо снижение О-В в кишечнике. Концентрация 109-1010 в 1 г.
« Условно бактероиды» - многочисленная группа грамотрицательных, палочковидных анаэробных бактерий. Роды: Bacteroides, Alistipes, Porphiromonas, Prevotella Содержание резко повышается и достигает концентрации взрослых 10 9-10 КОЕ/г. к 6-7 месяцам. Данные микроорганизмы стимулируют формирование иммунной системы ребенка, ускоряя созревание IgA- и IgG-секретирующих клеток «Биологический реактор» производство энергии
Особенности микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей раннего возраста. Лецитиназонегативные клостридии у 45,7% в конце 1-го месяца жизни, у 80-100% к концу 1 года. Лецитиназопозитивные у 30-40%. Производят бутират нутритивный фактор для колоноцитов. Стимулируют пролиферацию кишечного эпителия. К клостридиям пока отнесены Сегментированные фрагментарные филаментозные бактерии, не культивируются
. Эубактерии –грамположительные, неспорообразу-ющие палочковидные, анаэробы. В 10 месяцев у 33,3%, в 1 год 46,5% в количестве Lg 10,0 + 0,4. Пептострептококки облигатно анаэрбные, кокки. Встречаются у 33% -53,9% до 1 года.Концентрация Lg 9,9 + 0,5. Руминококки Сегментированные филаментозные бактерии, некультивируются Особенности микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей раннего возраста К клостридиям отнесены
Играют ключевую роль в постнатальном созревании иммунной функции толстой кишки Стимулируют Тн17 лимфоциты.
Клостридии. Clostridium difficile. Присутствуют в небольшом количестве. Их популяция Резко возрастает при использовании некоторых антибиотиков- клиндамицин.Вызывают псевдомембранозный колит
Эшерихии. Количество 106-108 в 1 г. Синтезируют 9 витаминов.
Эшерихии электронная микроскопия
Рост эшерихии на среде Эндо
Клебсиеллы. В высокой концентрации у детей 80-100% детей в возрасте 7-12 месяцев. После 1,5 лет элиминируются. Транзиторная микрофлора
Рост клебсиелл на агаре эндо. Микрофлора кишечника
Псевдомонады –окраска по Граму. Псевдомонады встречаются редко 3-5%
Кандида
Стафилококки. Коагулазонегатив-ные стафилококки у 80-100%, коагулазопозитив-ные у 60% детей раннего возраста.
Стрептококки
Стрептококки электронная микроскопия
Энтерококк
Энтерококк электронная микроскопия. Нормальный представитель микрофлоры. Концентрация 10 6 -108
Бациллы. Транзиторная микрофлора. У здоровых детей –редко.
Высокие популяционные уровни бифидобактерий и бактероидов у 100% детей. Лактобактерии не у всех. Высокая частота выделения и концентрация аллохтонных микроорганизмов: Коагулазопозитивные стафилококки Цитратассимилирующие энтеробактерии Эшерихии с низкой биохимической активностью и продуцирующие гемолизины. Лецитиназопозитивные клостридии. К концу первого года жизни происходит полная или частичная элиминация условнопатогенных бактерий
Нарушение качественного и количественного состава микрофлоры – опасно для здоровья. Основными механизмами, участвующими в контроле качественного и количественного состава микроорганизмов, являются факторы естественной резистентности и иммунологической защиты, созревание которых происходит по мере взросления ребенка. Контакты с бактериальными антигенами определяют созревание иммунной системы. Состав микрофлоры кишечника должен косвенно отражать особенности физиологического состояния как защитных, так и других систем организма в различные периоды жизни
Микрофлора кишечника рассматривается как метаболически активный орган Преобладающими группами микроорганизмов у людей более старшего возраста являются группы клостридий Бифидобактерии важнейшая и доминирующая группа микроорганизмов у грудных младенцев
Наружные половые органы- Стафилококки, зеленящие стрептококки, Энтерококки, пептострептококки, коринебактерии, энтеробактерии, неспорообразующие анаэробы, дрожжи.
Половые пути женщины: Плоский эпителий влагалища Цилиндрический эпителий шейки матки Вагинальный секрет
Вагинальный эпителий – сквамозный многослойный эпителий, созревание эпителиоцитов находится под контролем гормонов яичников(индуцируют накопление гликогена в вагинальном эпителии). Гликоген расщепляется лактобакте- риями с продукцией молочной кислоты. Низкие значения рН
Вагинальный эпителиоцит. К нему адгезированы лактобактерии(палочки Додерлайна). Поддерживают КР Влагалища, продуцируют молочную кислоту, перекись водорода.
Вагинальные лактобактерии. Количество их у женщин репродуктивного возраста 107-108Типичные представители: L. acidophilus L. fermentum L. plantarum L. casei
Лактобактерии препятствуют контаминации вагинального тракта экзогенными микроорганизмами и таким образом обеспечивают колонизационную резистентность. Антибактериальная активность прежде всего связана с выработкой в процессе брожения молочной и других органических кислот, что обеспечивает низкое содержание рН, а также – способность продуцировать перекись водорода назад
Выявляются у 7-12% здоровых женщин (во время беременности – выше 20%) и концентрациях варьируют от 10 3 до 10 7 КОЕ/мл. Выделяют большое количество кислых продуктов, тем способствуя поддержанию во влагалище кислой среды (низкой рН)
Относятся к представителям нормальной флоры генитального тракта. Частота их выделения в норме варьирует от 40 до 90 % случаев, а количество анаэробных кокков в вагинальном отделяемом составляет от 10 3 до 10 4 КОЕ/мл .
. Типичный представитель – P. а cnes, которые могут быть выделены с частотой до 25% в количестве 10 4 КОЕ/мл (в норме) назад
Неспоорбразующие, грамотрицательные анвэробные палочки. Основной вид – P.bivia и P.disiens. В норме частота встречаемости может достигать 60%, количественный уровень не превышает в норме 10 4 КОЕ/мл
Выделяются только у 5% здоровых женщин. Основное значение приобретают у женщин с бектериальным вагинозом. Отмечается значительное увеличение концентрации этих бактерий на фоне снижения уровня вагинальных лактобактерий, при этом частота контаминации достигает от 30% до 50% случаев. Обладают способностью прикрепляться к эпителиоцитам влагалища. Кроме того, у них обнаружены муколитические ферменты: муциназа, нейраминидаза
Вейлонелла облигатно анаэробные грамотрицательные кокки.
« Ключевые клетки»
« Ключевые клетки» Мобилюнкусы
Химиотерапевтический – назаначение антибиотиков (ампициллин, клиндамицин. Постлучевой – воздействие ионизирующей радиации(аплазия костного мозга, гибель микрофлоры и эпителиоцитов кишечника). Постинфекционный – после перенесенных инфекций. Воздействие стрессовых факторов.
Биологически активные вещества: Диетические добавки -естественые питатель-ные вещества(витамины, минералы, протеины, ферменты)+ микроорганизмы(пробиотики),используют как дополнение к основной пище. Функциональное питание – готовые для продажи пищевые продукты, в которые добавляют биопрепараты. Это модифицированные продукты, которые улучшают состояние здоровья более оптимально, чем исходный продукт (бифидокефир).
Пробиотики- живые микроорганизмы(бифидобактерии, лактобактерии), нормофлора кишечника здорового человека. Могут включаться в питание, как биодобавки.
Происхождение штамма - типичный для данной экологической ниши. Жизнеспособность – выживаемость в ЖКТ. Способность к адгезии. Высокая антагонистическая активность. Иммуномодулирующие свойства Модуляция метаболической активности индигенной флоры Безопасность Производственные характеристики
Влияние пробиотических препаратов на состав микрофлоры кишечника у детей раннего возраста Пробиотик – эффективно восстанавливает молочнокислую флору. Не приводит к элиминации условнопатогенных бактерий. Постоянная контаминация микроорганизмами окружающей среды Основными механизмами, участвующими в контроле качественного и количественного состава микроорганизмов,являются факторы естественной резистентности и иммунологической защиты, созревание которых происходит по мере взросления ребенка
Монокомпонентные - бифидумбактерин, Поликомпонентные - Линекс ( B.infantis, L.acidophilus, E. faecium ), Примадофилус Бифиформ (В. longum и E. faecium ). Комбинированные и сорбированные Бифилиз сухой ( B.bifidum и лизоцим). Пробифор (B. bifidum, адсорбированные на активированном угле
1995 год – Неперевариваемые компоненты пищи, способные избирательно стимулировать рост 1 и 2 видов микроорганизмов в толстой кишке. В настоящее время пребиотик и бифидогенный факторы уравнены. инулин и олигофруктоза, галактоолигосахариды Не адсорбируются, не расщепляются в верхних отделах ЖКТ
Моносодержащие Лактобактерин сухой ( L.plantarum 8RA-3) Поли-компонентные - Ацилакт сухой ( L.acidophilus - 3 разных штамма). Аципол (L.acidophilus и полисахарид кефирных грибков)
Пребиотики -цепи, состоящие из 3 - 10 мономеров углевода Низкий гликемичсекий индекс Низкое содержание калорий Устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека ( связи между фруктозой - и глюкозой, с короткоцепочечными жирными кислотами) Большинство бифидобактерий обладает соответствующим β -fructosidase
Смесь пробиотика и пребиотика. В идеале –синергизм.
Изолированы и охарактеризованы молекулярно-генетическими методами новые перспективные штаммы бифидобактерий. С использованием технологии рекомбинантных ДНК получены генетически измененные штаммы. создаются пробиотические штаммы с заданными уникальными свойствами.
В нашей лаборатории созданы оригинальные векторные системы: Для получения рекомбинантных бифидобактерий-продуцентов фактора роста фибробластов и интерлейкина –10 - цитокинов (ИЛ-10 способен уменьшать продукцию ИЛ-1, фактора некроза опухолей, ИЛ-6 макрофагами), является противовоспалительным цитокином. Эти штаммы перспективны для лечения неспецифического язвенного колита болезни Крона язвенно-некротического энтероколита недоношенных.
Развитие генной инженерии бифидобактерий позволит создавать пробиотические штаммы бифидобактерий с заданными свойствами – способными продуцировать рекомбинантные человеческие белки – цитокины, ферменты, антитела.
