Выполнила Кушниренко Дарья, студентка группы 224 М
Соматический гибрид нормальной антителообразующей и опухолевой клеток ( гибридóма ) дает потомство, обладающее бессмертием опухолевой клетки и способностью к синтезу антител, унаследованному от клетки нормальной. Гибридомы продуцируют огромное количество моноклональных антител, обладающих уникальной специфичностью.
1. Производство моноклональных антител 2. Изучение генетических заболеваний 3. Разработка лекарственных препаратов 4. Регенеративная медицина
1. Иммунизация мышей и получение клеток селезенки (спленоцитов). 2. Культивирование и получение мутантных клеток миеломы. 3. Слияние клеток миеломы и иммунных спленоцитов. 4. Селекция на среде НАТ (ГAT). 5. Поиск и клонирование гибридом. 6. Отбор клонов, синтезирующих специфические антитела. 7. Наработка моноклональных АТ in vitro / in vivo. Условные обозначения: А, В, С — многокомпонентная смесь антигенов, использованная для иммунизации; АОК — антителообразующие клетки селезенки; Пл — клетки плазмоцитомы, не растущие в селективной ГАТ-среде; ПЭГ — полиэтиленгликоль; ГАТ — среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин, тимидин; анти-А, анти-В, анти-С — моноклональные антитела соответственно к А-, В-, С-антигенам.
Мышей интенсивно иммунизировали определенным материалом — белком, бактериальной клеткой или клеткой животного происхождения. Когда в их крови появлялись антитела, у них брали селезенку и лимфатические узлы (места скопления АОК ( антителобразующие клетки ) ), и из них готовили взвесь клеток. Лабораторные животные (млекопитающие, в основном, мыши) подвергаются иммунизации, обычно, путём нескольких инъекций антигена в течение 1-2 месяцев. Преимущественно используют 2 линии мышей – BALB/C и SJL. Использование гибридных мышей первого поколения (F1), полученных при скрещивании этих двух видов, крайне перспективны для иммунизации и получения иммунных В-лимфоцитов. Полученные из таких клеток гибридомы не вызывают отторжения при прививке обеим линиям мышей, что позволяет проводить наработку антител гибридом, как в BALB\C, так и SJL мышах. Животные должны не обладать специфицированной патогенной микрофлорой (SPF), в связи с чем выращиваются в специализированных питомниках. Синтезирующие антитела клетки извлекают из селезенки животного.
Клетки (иммунные В - лимфоциты мыши и клетки миеломы) помещают в одну емкость. Слияние клеток стимулируется с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль (ПЭГ, молекулярный вес 1500-2000) или вирус Сёндай. Механизмы слияния в значительной степени остаются до конца неизученными. Предполагают, что полиэтиленгликоль уменьшает заряд клеточной поверхности и сорбирует на себе воду, облегчая тем самым взаимный контакт плазматических мембран соседних клеток. При слиянии плазматических мембран клеток образуются клетки с двумя или большим числом ядер – гетерокарионы. После первого деления ядра сливаются и образуются одно ядро с набором хромосом от всех слившихся партнеров, т.е. образуется гибридная клетка.
Поскольку частота образования гибридных клеток крайне низка, для их выделения необходимы селективные среды, позволяющие расти преимущественно образовавшимся гибридам. Одним из наиболее распространенных является метод, основанный на применении системы: гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Аминоптерин блокирует основной путь биосинтеза как пуринов, так и пиримидинов, а гипоксантин и тимидин – обходные пути. При культивировании на среде ГАТ родительские миеломные клетки погибают (т.к. не содержат ген ГГФТ, позволяющий клетке обойти влияние ГАТ), а клетки селезенки (В-лимфоциты) не обладают способностью к пролиферации при данных условиях культивирования, поэтому выживают и размножаются исключительно гибридные клетки, унаследовавшие способность размножаться и синтезировать специфические иммуноглобулины. Но многие гибридомы, полученные после слияния, синтезируют не только адресные антитела («антитела интереса») клеток иммунной селезенки, но и другие иммуноглобулины (от спонтанных партнеров по слиянию). Именно поэтому далее следует процесс селекции гибридом.
Клеточную суспензию делят на линии, которые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных планшетов. Далее в среде над клетками определяют методом твердофазного ИФА искомые антитела. Клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся, отбраковывают. При использовании метода «минимальных разведений» клеточной суспензии в одну лунку попадает не более одной гибридной клетки. Для гарантированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные линии могут быть ещё раз клонированы с тем, чтобы антитела производились потомками одной гибридной клетки, то есть были моноклональными.
Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки 96-луночного планшета в сосуды большей ёмкости для размножения. Наработку антител полученными гибридомами проводят в животных в условиях in vivo или культивированием в ферментаторах в условиях in vitro. В первом случае клеточную суспензию вводят в брюшную полость мышей, где гибридома размножается и секретирует антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопления жидкости в брюшной полости). Асцит собирают и проводят очистку моноклональных антител методами аффинной хроматографии. Хранения гибридомы осуществляется посредством криоконсервации в жидком азоте.
