Распределение времени- Введение и актуальность - 2мин Этиология и факторы риска– 12 мин Диагностика -15 мин Лечение – 36 мин Рецидивы– 20 мин Эффективность терапии – 5 мин.
Кафедра педиатрии и неонатологии НГМУ К.м.н., доцент Казначеев К.С.
Лейкоз является наиболее частой формой гемобластозов в детском возрасте. Среди всех форм лейкозов у детей наблюдается в подавляющем большинстве случаев острый лейкоз. Развитие острого лейкоза обусловлено моноклоновой пролиферацией бластных клеток костного мозга, тогда как хронический миелолейкоз (ХМЛ) представляет собой поликлоновую опухоль с пролиферацией клеток гранулоцитарного ростка костного мозга на всех этапах дифференцировки. Клиническая картина острого лейкоза характеризуется наличием анемического, геморрагического, гнойно-септического, пролиферативного и костно-суставного синдромов. Это обусловливает необходимость дифференциальной диагностики с другими лимфопролиферативными заболеваниями (лимфогранулематоз, лимфомы, ретикулогистиоцитоз ), неспецифическими лимфаденопатиями, инфекционным мононуклеозом. Дифференциальная диагностика острого лейкоза основывается на характерных показателях гемограммы и миелограммы (лейкемический провал, отсутствие промежуточных форм клеток). Лечение острого лейкоза зависит от его цитохимического варианта (ОЛЛ или ОМЛ), степени риска и периода заболевания.
Актуальность темы Частота на 1 млн в год ОЛЛ 35 ОМЛ 7 Лимфомы 7 ~ 2500 заболевших в год ~ 12 000 детей под наблюдением 40%-45% всех опухолей у детей 2-я причина смерти детей > 2- х лет
Острый лейкоз заканчивается летально без лечения в 100% До эры химиопрепаратов все больные погибали в течение 3 месяцев от инфекций либо геморрагий За 50 лет достигнуты большие успехи в терапии лейкозов – 5 выживаемость – 70%, а в ряде случаев выздоровление. Полихимиотерапия, пересадка костного мозга и таргетные препараты
ГЕМОБЛАСТОЗЫ Преимущественно в костном мозге ЛЕЙКОЗЫ Преимущественно вне костного мозга ЛИМФОМЫ ( ГЕМАТОСАРКОМЫ) ОСТРЫЕ ЛЕЙКОЗЫ ХРОНИЧЕСКИЕ ЛЕЙКОЗЫ ЛИМФОГРАНУЛЕМАТОЗ (БОЛЕЗНЬ ХОДЖКИНА) ЛИМФОМЫ НЕХОДЖКИНСКИЕ (ЛИМФОЦИТАРЫЕ, ЛИФОБЛАСТНЫЕ) ГИСТИОЦИТАРНЫЕ
Традиционно все лейкозы делятся на острые (ОЛ) и хронические (ХЛ) Выделение ОЛ и ХЛ основано на способности опухолевых клеток к дифференцировке (созреванию). Хронический вариант лейкемии диагностируется в случае, когда опухолевая клетка на определенном этапе болезни способна к дифференцировке. Острый лейкоз диагностируется в случае, когда первично мутировавшая гемопоэтическая клетка не способна к дифференцировке, а может лишь воспроизводить саму себя, что приводит к накопление огромного количества незрелых бластных клеток и угнетение нормального кроветворения.
Острый лейкоз выделен в отдельную нозологию в середине 19 века Миелобласт описан в 1900 г. Нагели, он же разделил лейкозы на миелоидные и лимфоидные Острый моноцитарный лейкоз описан в 1913 году Решадом Острый промиелоцитарный лейкоз в 1957 Хильштадом
первый случай ОЛ -1827 год описание и термин «лейкемия» -1845 г., Рудольф Вирхов первый случай излечения -1930 г., клиника Негели., Швейцария: облучение, мышьяк первые цитостатики :1948г. метотрексат, 1960 г. 6-МП первая программа терапии: 1962г. Д. Пинкель, St.Jude Children Hospital
«В основе опухолевого роста всех гемобластозов лежит клональность – каждый лейкоз или гематосаркома всей массой своих клеток обязаны мутации в их родоначальной клетке» (Воробьев А.И.)
Ионизирующая радиация, лучевая терапия (20-40 рад) Химические мутагены (цитостатические препараты: мустарген, циклофосфан и др.); например, вторичные лейкозы после лечения лимфогранулематоза комбинацией лучевой терапии и мустаргена Вирусы (Эпштейн-Барр – лимфома Беркитта). Вирус – стимулятор. Наследственность
Группы риска Установленный риск Относительный риск по отношению к риску у здоровых детей Здоровые дети 1 :23 750 до 15-летнего возраста 1,0 1:28 000 до 10-летнего возраста 1,0 Братья, сестры ребенка, больного лейкозом 1 :21 800 до 15-летнего возраста 1,1 Идентичные близнецы ребенка, больного лейкозом 1:8 до 10-летнего возраста 350,0 Болезнь Дауна 1:74 до 10-летнего возраста 37,0 Анемия Фанкони 1:12 до возраста 21 год 1979,0 Синдром Блюма 1:8 до возраста 26 лет 2969,0 Синдром Луи-Бар 1 :8 до возраста 25 лет 2969,0 Лица, подвергшиеся облучению: Находившиеся в пределах 1 км от взрыва атомной бомбы 1:60 в течение 12 лет 47,0 После рентгенотерапии в связи с: анкилозирующим спондилезом 1:720 в течение 25 лет 33,0 полицитемией 1 :6 в течение 12 лет 457,0 Контакт с бензолом 11960 в течение 12 лет 2,9 Леченные алкилирующими лекарствами 1 : 500 в течение 20 лет 47,5 Риск лейкоза в отдельных популяционных группах (Миллер Д.Р., 1990)
Клональность – излечение Опухолевая прогрессия – 10 3 -10 6 - 10 12 Гемобластозы проходят 2 стадии Моноклоновую Поликлоновую Угнетение ростков кроветворения (особенно гомолога ) Закономерно развитие бластного криза – смена зрелых клеток – бластными Все внекостномозговые гемобластозы способны лейкемизироваться Метастазы лейкоза (нейролейкемия, гонады) – это другой субклон Резистентность к терапии - это качественно новый этап развития опухоли Апоптоз (р53, bcl – 2)
Три разновидности классификаций: нозологическая, по стадиям С определение группы риска неблагоприятного прогноза. Современная классификация онкогематологического заболевания должна ответить на 3 вопроса, определяющие прогноз заболевания : Какая линия( ряд) гемопоэза поражен? Какого уровня вызревания достигают опухолевые клетки ? Какие изменения генотипа присутствуют в опухолевом клоне?
По гисто- (цито-) генезу, характеру и направлению дифференцировки разрастающихся клеток: Среди острых лейкозов выделяют: - недифференцированный; - миелобластный; - лимфобластный; - монобластный (миеломонобластный); - эритробластный; - мегакариобластный. Среди хронических лейкозов Лейкозы миелоцитарного происхождения: - хронический миелоидный лейкоз; - эритремия; - истинная полицитемия Вакеза-Ослера и др. Лейкозы лимфоцитарного происхождения: - хронический лимфоидный лейкоз; - лимфоматоз кожи (болезнь Сезари); - парапротеинемические лейкозы (миеломная болезнь, первичная макроглобулинемия Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей Франклина). Лейкозы моноцитарного происхождения: - хронический моноцитарный лейкоз; - гистиоцитозы. Классификация лейкозов.
I.Начальный II. Период разгара заболевания III. Период ремиссии IV. Период обострения (рецидив) V. Терминальный период
- характеризуется признаками неспецифической интоксикации, оссалгиями (патогномоничный синдром) Кровь: умеренная анемия, стойкая лейко -, тромбоцитопения, ускоренная СОЭ. В норме бластных клеток в костном мозге - 0,5-1,5 %.
Особенности клиническое картины Интоксикационный синдром (более выражен при острых лейкозах) Анемический (циркуляторно-гипоксический синдром) Лимфопролиферативный синдром (лимфоаденопатия и спленомегалия - более характерны для лимфоидных лейкозов) Геморрагический синдром Инфекционный синдром (лихорадка, некротические ангины, септическое состояние) Поражение кожи (лейкемиды) Нейролейкемия (параличи, парезы, комы неясного генеза) – чаще при лимфобластных лейкозах Поражение гонад
Поражение длинных трубчатых костей при остром лимфобластном лейкозе
Острые эрозия и язвы желудка Субэпикардиальные кровоизлияния Клиника острых лейкозов Геморрагический синдром
лимфаденит, эпидемический паротит, туберкулез, лимфогранулематоз, ревматизм, ревматоидный артрит, гепатиты, инфекционный мононуклеоз, острый аппендицит, затяжные простудные заболевания, ангины, длительные язвено - некротические стоматиты, сепсис, апластическая анемия, гемолитическая анемия, тромбоцитопеническая пурпура, геморрагический васкулит, дизентерия, мелкоочаговая пневмония.
2. Изменения в периферической крови подозрительные на лейкоз: Гипоплазия 2-х ростков кроветворения (анемия и тромбоцитопения, лейкопения и тромбоцитопения, лейкопения и анемия) Лейкоцитоз свыше 20 х 10 9 при отсутствии признаков явного инфекционного процесса Лимфоцитоз, моноцитоз > 48 % Одновременно эритроцитоз, гемоглобинемия, лейкоцитоз, тромбоцитоз
Анемия как правило нормохромная (снижение гемоглобина ниже 100 г/л) выявляется у 85% пациентов Лейкопения менее 4х10 9 /л - у 20%, а лейкоцитоз более 10х10 9 /л - у 50% пациентов Тромбоцитопения менее 100Х10 9 /л - у 80% пациентов. Практически у всех больных (98%) в периферической крови выявляются бластные клетки. Характерно, так называемое, " лейкемическое зияние": в лейкоцитарной формуле больного ОЛЛ регистрируются бластные формы и далее без наличия переходных форм (промиелоцитов и миелоцитов) имеются зрелые гранулоциты, число которых может быть значительно снижено за счет увеличения содержания лимфоцитов или бластных клеток.
Анализ крови клинический - лейкоцитоз/лейкопения – более 50 тыс /? - анемия, тромбоцитопения - относительный лимфоцитоз, моноцитоз - бластоз – любое число клеток Биохимический анализ крови - ЛДГ, другие показатели, определение «иммунного статуса» - неинформативны!
Клинический анализ крови + морфология Морфология клеток костного мозга (пунктат костного мозга) Цитохимические исследования клеток костного мозга Цитогенетические исследования клеток крови и костного мозга Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга Гистологические исследования костного мозга (трепанобиопсия) Иммуногистохимические исследования Диагноз острого лейкоза можно установить только морфологически –по обнаружению несомненно бластных опухолевых клеток в крови или костном мозге – 20% бластов
Рентгенография грудной клетки исследование костно-мозгового субстрата - передне/заднеподвздошная пункция – доля бластов более 20 (25)% исследование ликвора - люмбальная пункция – любое число бластов НИИ детской гематологии
Метастазирование бластных клеток в ЦНС. 1) контактный путь – из костей черепа и позвоночника на твердую мозговую оболочку, черепные и спинно-мозговые нервы, 2) диапедезный – из переполненных сосудов мягкой оболочки в ликвор и в вещество мозга по околососудистым пространствам.
менингиальная (мозговые оболочки) энцефалитическая (вещество мозга) менингоэнцефалическая поражение периферических стволов
В ликворе - вариабельный цитоз до нескольких тысяч клеток в 1 мкл., повышение уровня белка и снижение уровня глюкозы, цвет жидкости, как правило, сероватый, с положительной реакцией Панди. Клинические проявления - могут не наблюдаться; - могут быть самыми разнообразными : изменение поведения: раздражительность, вялость, необщительность. появляется головная боль, тошнота, рвота (при менингиальной форме), очаговая симптоматика в виде поражения черепных нервов, пирамидной недостаточности, мозжечковых симптомов, судорог, нарушения речи и сознания (при менингоэнцефалической и энцефалической форме ), нижних парапарезов, нарушение походки и функции тазовых органов, корешковых симптомов (при менингомиелитической форме).
Костный мозг
ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ КРОВЬ
Морфологическая оценка аспирата костного мозга (миелограмма)
При острых лимфобластных лейкозах определяется отрицательная реакция на пероксидазу, липиды, хлорацетатэстеразу. При острых миелобластных лейкозах - положительная реакция на миелопероксидазу, липиды, хлорацетатэстеразу. ШИК-реакция зависит от формы острого миелоидного лейкоза. Маркер моноцитарного ряда выраженная активность неспецифической эстеразы, ингибирумая NaF
G- бенд FISH – метод ПЦР Транслокации Делеции Инверсии
Миелоидные лейкозы t (8 ;21) – А ML-ETO – M2 t (15 ;17) – PML-RARa – M3 Inv (16) – M4 t (1 ;22) – М7 Лимфобластные лейкозы t ( 9;22) – р190 t ( 4;11) t ( 1;19 )
Клетки крови обрабатываются моноклональными антителами с флюоресцирующей меткой и направляют с потоком жидкости в капилляр освещенный лазером. Методика чрезвычайно эффективна в диагностике лейкозов. Характеристика лейкемий с помощью иммунофенотипирования особенно полезна, когда морфологию лейкозных клеток трудной интерпретировать.
Для подтверждения миелоидной природы лейкоза применяют мАТ к антигенам CD11, CD13, CD15, CD33,CDw65 и MPO Коэкспрессия С D14 и С D64 характерна для меломоно-и монобластных лейкозов М7- С D41, CD42, CD61 М6-гликофорин А Лимфобластные – С D22, CD19
TGCTGACCAACTCGTGTGTGAAAC AAGCAGAGTTCAA -aagcccttcagc СТРУКТУРА ТРЕХМЕРНОГО ГЕЛЕВОГО БИОЧИПА
ALL/CML-BIOCHIP
1. Общий анализ крови + тромбоциты + СОЭ 2. R о-графия ОГК, костей 3. УЗИ органов брюшной полости 4. Биохимический анализ крови (глюкоза, белок, креатинин, мочевина, АЛТ, АСТ, ЩФ, К, Na ) 5. Вирусологическое исследование (НВ s А g, ВПГ,ЦМВ) 6. Люмбальная пункция - цитоз+белок, цитология, посев на стерильность, сахар 7. Стернальная пункция - иммунофенотипическое, цитохимическое, миелограмма, цитогенетическое исследование.
Полихимиотерапия Сопроводительная терапия Аллогенная трансплантация костного мозга Аутологичная трансплантация костного мозга
Интенсивная полихимиотерапия в течение 6 месяцев и поддерживающая- сроком до 2 лет. І. Индукция ремиссии (добиваются уменьшения числа бластных клеток до единичных в препарате костного мозга). ІІ. Консолидация ремиссии (продление ремисии, реиндукция – противорецидивное лечение). ІІІ. Поддерживающия терапия (в интервалах между редукциями и консолидацией).
Учет конкретной формы лейкозы Комбинация химиопрепаратов Расчет дозы химиопрепаратов на м 2 Четкое соблюдение интервалов между курсами Т.Е. полное и четкое выполнение протокола лечения. Адекватная сопроводительная терапия
Индукция ремиссии 10 12 10 6 Консолидация ремиссии Поддерживающая терапия Профилактика нейролейкемии
Индукция ремиссии Консолидация ремиссии Поддерживающая терапия Профилактика нейролейкемии 10 12 10 6 10 6
Динамика опухолевой массы в процессе лечения острого лейкоза. Возможность излечения.
Алкилирующие агенты (лейкеран, мелфолан, циклофосфан) Антиметаболиты (метотрексат, цитарабин, меркаптопурин) Противоопухолевые антибиотики (доксорубицин, даунорубицин, митоксантрол) Препараты растительного происхождения (винкристин, винбластин) Другие (ферменты, гормоны)
Непрерывная терапия 2-3 года Индукция винкристин+глюкокортикоиды + l-asp+ антрациклины Консолидация/интенсификация Циклофосфамид, Ara -C, Н D Mtx Индукция 2 винкристин+глюкокортикоиды + l-asp +/- антрациклины Поддерживающая терапия М tx+6- МП +/- Vc + глюкокортикоиды
Терапия оккультной нейролейкемии Множественные э/л введения Mtx +/- AraC +/- ГКС Н D Mtx (> 5 000 мг/м 2 ) продленная терапия L- аспарагиназой -облучение 12-18 Гй Площадь поверхности тела Объем ЦНС Возраст % от значения у взрослых ОЛЛ. Принципы терапии 2
Induction DNR 45 mg/mІ VCR 1,5 mg/mІ DEXA 6 mg/mІ ASP 10 KU/mІ TIT BMP 15 22 29 36 1 8 if more than 10% blasts in BM day 43 Protocol MB 2008 Standard Risk
week 7 13 15 21 29 23 31 MTX 30 mg/mІ VCR 1,5 mg/mІ DEXA 6 mg/mІ 6-MP 50 mg/mІ ASP 10 KU/mІ TIT Protocol MB 2008 Standard Risk Consolidation
Protocol MB 2008 high risk Consolidation week 7 13 15 21 29 23 31 MTX 30 mg/mІ VCR 1,5 mg/mІ DEXA 6 mg/mІ 6-MP 50 mg/mІ L-ASP 10 KU/mІ i.th. DNR 30 mg/mІ cran.irrad.
Миелотоксический агранулоцитоз (всегда)- через неделю после курса Инфекции Сепсис Пневмония Стоматит Проктит Некротическая энтеропатия
Стерильный блок!! Современные антибиотики и противогрибковые препараты Тромбоцитарная масса Эритроцитарная масса Свежезамороженная плазма Профилактика синдрома лизиса опухоли – адекватная водная нагрузка, форсированный диурез, аллопуринол Профилактика тошноты и рвоты
Стерильный блок!! Современные антибиотики и противогрибковые препараты Тромбоцитарная масса Эритроцитарная масса Свежезамороженная плазма Профилактика синдрома лизиса опухоли – адекватная водная нагрузка, форсированный диурез, аллопуринол Профилактика тошноты и рвоты Адекватный сосудистый доступ – препараты только в/в (центральный катетер ) В/М !!
1) отсутствие клинических признаков - 1 мес. ; 2) миелограмма : не более 5% бластных клеток, не более 30% лимфоцитов ; 3) восстановление соотношения эритроцитарного и гранулоцитарного ростков (1:3) ; 4) нормализация периферической крови : - Нв не < 120 г/л, - лейкоциты - не < 4х10 9 /л, - тромбоциты - > 100 тыс., - отсутствие бластов.
Клинико-лабораторная ремиссии– менее 5% бластов в костном мозге Цитогенетическая ремиссия – исчезновение патологического клона Молекулярная ремиссия – отсутствие химерного белка Минимальная остаточная болезнь – остаточная популяция лейкемических клеток выявляемая только высокочувствительными методами
Рецидив - восстановление клинических, гематологических признаков лейкоза. Виды: - ранний - до 6 мес. после поддерживающей терапии * очень ранний - до 18 мес. от начала заболевания * поздний - после 6 мес. после поддерживающей терапии Проявляется: - медуллярными ( костно-мозговые нарушения); - экстрамедуллярными очагами (в почках, миокарде, печени, селезенке, нейролейкоз ). У мальчиков - орхиты, эпидидимиты. У девочек - поражение яичников.
Рецидивы ОЛЛ у детей, лечение. A LL-REZ BFM 83 - 87 5-летняя выживаемость в зависимости от сроков возникновения очень ранние 0.14 ранние 0.20 поздние 0.45 в зависимости от локализации: экстрамедуллярные 0.50 комбинированные 0.39 изолированные КМ 0.21 в зависимости от иммунофенотипа Т-ОЛЛ 0.16 другие 0.33
Рецидивы ОЛЛ у детей результаты ALL REZ BFM90 в НИИ ДГ в зависимости от инициальной терапии Непрограммная, EFS 0,63 Программная, EFS 0,28
- трансплантация костного мозга : аллогенным костным мозгом (с удалением Т-лимфоцитами), трансплантируют сразу после достижения ремиссии; аутогенным костным мозгом - забирают после достижения ремиссии + обрабатывают моноклональными антителами, фармакологическими препаратами, и вводят больному;
Н LA – идентичный сиблинг (типирование родственников) Проводится в ремиссию (т.е. после курса химиотерапии), у больных с неблаг. прогнозом В/в капельное введение CD34+ - клеток донора Результаты существенно лучше в 1 ремиссию Болезнь «транплантат против хозяина» Позитивный эффект «трансплантат против лейкоза» - переливание лимфоцитов донора 70-80% - 5 летняя выживаемость (реальный шанс на выздоровление)
Собственные С D 34+ клетки, забранные в ремиссию Большие дозы химиопрепаратов (Несмотря на уменьшение частоты рецидивов, смертность от процедуры 13%,) Показания не однозначные
Target – мишень Развитие молекулярной биологии Направлено на основной молекулярный дефект ведущий к болезни
Острый промиелоцитарный лейкоз Полностью транс-ретиноевая кислота (А TRA) Острый лимфобластный лейкоз ( Ph+) Ингибиторы тирозинкиназы – Гливек ХМЛ Ингибиторы тирозинкиназы – Гливек ХЛЛ и лимфомы Моноклональные антитела к CD20 (Мабтера) и С D 52 ( Кемпас)
Интенсивная индукция AraC +антрациклины Интенсивный тайминг 3-4 цикла постремиссионной терапии с HD AraC Химиопрофилактика ЦНС Алло ТКМ для всех кроме низкого риска Отсутствие поддерживающего лечения
Риск ранней смерти гиперлейкоцитоз, коагулопатия Риск невыхода в ремиссию и рецидива Высокий 60- 9 0% t(3; 3 ) -7, -5,del5q, вторичные ОМЛ, аномалии 11q23, Промежуточный 40-50% N кариотип,+8,+21, del7, t(9;11 ) Низкий 20-30% t(8;21),t(15;17) inv16
Протокол LAME 89/91(Франция) AraC+Nov 60 ADE4 Алло-ТКМ С apizzi+M-AMSA 6МП+ AraC Stop S с haison G et al. В one Marrow Transplant 1996(17):191-196 Алло ТКМ vs интенсивная ХТ Смертность от осложнений: ТКМ -3,3% ХТ - 7,7%
Вероятность рецидива Алло ТКМ Ауто ТКМ ХТ W. G. Woods Blood, 2001, 97:. 56-62 Протокол CCG-2891. ОМЛ у детей Безрецидивная выживаемость Алло ТКМ vs интенсивная ХТ
ОМЛ у детей АутоТКМ vs интенсивная ХТ Протокол MRC 10 Безрецидивная выживаемость Burnett A, Lancet 2000
Не вызывает затруднений, если морфологически подтвержден бластоз в пунктате или в периферической крови. Трудности возникают на первых этапах – при анализе мазков периферической крови, когда нет бластов. Увеличение числа лейкоцитов со сдвигом формулы влево при различных инфекционных процессах может вызывать сомнения в диагнозе острого лейкоза, но никогда в таких случаях не обнаруживаются бластные клетки. Увеличение числа лейкоцитов при тяжелых инфекциях (например, менингококкемии ) может сопровождаться снижением числа тромбоцитов, анемией, геморрагическим синдромом. В данной ситуации, когда диагноз неясен, необходима стерильная пункция. И только обнаружение бластоза в пунктате становится основанием для диагноза острого лейкоза.
Острый лейкоз следует отличать от апластической анемии, аплазий кроветворения после приема лекарственных препаратов, иммунных цитопений, метастазов рака в костный мозг, от опухолей, которые могут инфильтрировать костный мозг ( нейробластома, саркома Юинга, мелкоклеточный рак легких, лимфосаркома ). Единственным критерием диагноза острого лейкоза является обнаружение бластных клеток в пунктате.
Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и механизмы ее возникновения / Б.П. Копнин // Канцерогенез / под ред. Д.Г. Заридзе. — М.: Медицина, 2004 В.С. Турусов, Г.А. Белицкий, Л.Н. Пылев, В.А. Кобляков. Химический канцерогенез // //. — М.: Медицина, 2004. Френкель М.А. Костномозговое кроветворение. // М.А. Френкель // Клиническая онкогематология: руководство для врачей / под ред. М.А. Волковой. — М.: Медицина, 2001. — С. 9–22. Клиническая онкогематология. Под ред. М.А.Волковой. М. Медицина, 2001, 572 стр. Практическое руководство по детским болезням. Гематология и онкология детского возраста. Под редакцией А.Г.Румянцева, Е.В Самочатовой Том 4-ый. Медпрактика.М. 2004. Румянцев А.Г., Масчан А.А., Самочатова Е.В. Сопроводительная терапия и контроль инфекций при гематологических и онкологических заболеваниях. Медпрактика. М. 2006.
