![Salmonella enterica Серовара 4,[5],12:i:- Salmonella Typhimurium and Salmonella Derby, Enteritidis](https://s0.showslide.ru/s_slide/09dc/50ccff89-2c4b-48c9-9d9f-4a08b963fc29.jpeg.webp "Сальмонелла: от рем.молодняка до мяса на прилавке")
Докладчик: к.б.н. Афонюшкин Василий Николаевич зав сектором молекулярной биологии СФНЦА РАН, сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, организатор клуба любителей дохлых кур, организатор секции по птицеводству «Ветеринария в АПК»
Сальмонелла является одним из наиболее распространенных зоонозных патогенов пищевого происхождения и представляет угрозу для общественного здравоохранения во всем мире. Salmonella enterica является наиболее патогенным среди видов Salmonella и включает более 2500 сероваров.. Он вызывает брюшной тиф и гастроэнтерит, а серовары, ответственные за последнее заболевание, известны как нетифоидные сальмонеллы (NTS). Сальмонелла Передача сальмонеллы человеку происходит на протяжении всего цикла «от фермы до вилки» через зараженные продукты животного и растительного происхождения, включая птицу, яйца, рыбу, свинину, говядина, овощи, фрукты, орехи и мука Сальмонелла тифоидная ( S almonella enterica серовар Typhi) и S. Paratyph i вызывают брюшной тиф — системное лихорадочное заболевание, поражающее только людей. Другие многочисленные серовары NTS, такие как S. Typhimurium и S. Enteritidis инфицируют множество различных хозяев и приводят к диарейным заболеваниям. NTS также вызывает тяжелую внекишечную инвазивную бактериемию, называемую инвазивным заболеванием NTS (iNTS)
По оценкам Всемирной организации здравоохранения, в 2010 году во всем мире было зарегистрировано 153 миллиона внекишечных форм сальмонеллеза (NTS), из которых 56 969 были смертельными и почти половина была связана с пищевыми продуктами и 91% случаев в Африке. На серовар Typhimurium (Salmonella enterica) и серовар Enteritidis приходится почти 60% всех вспышек сальмонеллеза у людей.
Домен: Бактерии Тип: Протеобактерии Класс: Гамма-протеобактерии Порядок: Enterobacterales Семейство Enterobacteriaceae Род: Сальмонеллы Грамотрицательные, факультативные анаэробы, большинство подвижно (благодаря перитрихиям, то есть расположенным по всей поверхности бактерии жгутикам). На плотных питательных средах образуют круглые колонии серовато-белого цвета, при росте на бульоне — помутнение и осадок. В мазках располагаются беспорядочно. Не образуют спор, имеют микрокапсулу, перитрихи. Сальмонеллы сбраживают углеводы (глюкозу, маннозу, ксилозу, декстрин) и спирты (инозит, дульцит) с образованием кислоты, а иногда и газа. Оптимальными для роста являются температура 37 °C, рН среды 7,2—7,4. Они неприхотливы и растут на простых питательных средах.
Схематическая демонстрация (A) механизма устойчивости Salmonella к фагоцитарному разрушению: 1. предотвращение слияния фаголизосом, 2. устойчивость к окислительному и нитрозативному стрессу, 3. устойчивость к антимикробным пептидам, 4. ингибирование макрофагально-опосредованного воспаления). (B) Механизмы интернализации (течения инфекции) сальмонеллы. Как только Сальмонеллы достигают просвета кишечника, они могут пройти через эпителиальный слой либо путем (1) пассивного поглощения, осуществляемого дендритными клетками; (2) инвазия через М-клетки; (3 и 4) репликация и выживаемость бактерий; (5) секреция цитокинов, воспаление и/или апоптоз; (6 и 7) базолатеральная инвазия для повторного посева обратно в просвет кишки, что приводит к выделению агента с калом. (C) Колонизация нефагоцитарных клеток-хозяев (фибробластов, эндотелиальных и эпителиальных клеток) по триггерному механизму. SCV, сальмонелласодержащая вакуоль. https://www.mdpi.com/2304-8158/12/9/1756
Биопленки основном состоят из O-антигена, амилоидных фимбрий, белка, ассоциированного с биопленкой (Bap), целлюлозы и внеклеточной ДНК. Соответственно, штаммы продуцирующие целлюлозу растут на агаре с конго-красным в виде синих колоний Регуляция медиаторами чувства кворума бис-3'-5'-циклическим димерным гуанозинмонофосфатом Схематическое изображение различных типов систем секреции, которые участвуют в сальмонеллезной инфекции, а именно I (T1SS), III (T3SS), IV (T4SS) и VI (Т6СС). HM, мембрана клетки-хозяина; IM – внутренняя мембрана бактерий; ОМ, наружная мембрана. https://www.mdpi.com/2304-8158/12/9/1756
Мобильные детерминанты антибиотикоустойчивости белок устойчивости к хинолонам (Qnr) ß-лактамы, фторхинолоны и карбапенемы (гены qepA и oqxAB ) Макролидфосфорилаза Ген McrI (устойчивость к колистину)
https://www.pasteur.fr/sites/default/files/veng_0.pdf
Подавление сальмонеллой гуморального иммунитета (Th2) Сальмонелла нарушает гуморальный иммунитет на нескольких стадиях; В-клеточный лимфопоэз, экспрессия MHC класса II в миелоидных клетках, образование зародышевого центра (GC), персистенция IgG-секретирующих плазматических клеток (PC) и концентрация IgG в сыворотке. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2019.03155/full Сальмонелла SiiE подавляет удержание IgG-секретирующих плазматических клеток в нишах выживания костного мозга (ВМ), конкурируя с ламинином β1. SiiE, секретируемый Salmonella, конкурирует с ламинином β1 за взаимодействие с интегрином β1. Конкуренция вызывает отслоение, а затем удаление IgG-секретирующих плазматических клеток из ламинина β1+CXCL12+ ниши выживания ВМ.
Врожденный иммунитет может выполнять несколько функций на ранней стадии инфекции, включая контроль репликации бактерий и выработку цитокинов и хемокинов, которые активируют и привлекают воспалительные клетки к месту инфекции. Численность макрофагов, нейтрофилов и дендритных клеток увеличивается вскоре после заражения Salmonella и способствует накоплению цитокинов, важных для выживания хозяина, такие как TNFα. Все три типа фагоцитирующих клеток также содержат бактерии во время инфекции. IFNγ из естественных клеток-киллеров на самой ранней фазе инфекции и из Т-клеток на поздней фазе инфекции может активировать макрофаги и способствовать завершенному фагоцитозу. Помимо врожденных клеток, для выведения бактерий из тканей также необходимы функциональные CD4 Т-клетки, которые обеспечивают формирование долгосрочного иммунитета. Обнаружен некоторый вклад С D 8+Т киллеров и натуральных киллеров. IL-12, IFNγ, активные формы кислорода или индуцибельный оксид азота являются важными факторами от которых зависит элиминация сальмонелл из организма Тем не менее, сальмонеллы научились использовать TLR- сигнальные пути для повышения своей патогенности и выживания внутри макрофагов Когда S. Typhimurium вступает в контакт с макрофагами, патоген-ассоциированные молекулярные структуры (PAMP) распознаются Toll-подобными рецепторами (TLR), которые активируют путь TLR, что приводит к активации интерлейкинов и воспалительных цитокинов. PAMP фагоцитированных бактерий также активируют пути TLR и Nod-подобных рецепторов (NLR). Бактериальная ДНК, высвобождаемая в цитозоль макрофагов, распознается цитозольным ДНК-чувствительным путем и приводит к активации интерферона. Образующиеся интерлейкины распознаются рецепторами интерлейкинов и инициируют экспрессию воспалительных цитокинов. https://www.researchgate.net/publication/360368354_Transcriptome_Analyses_of_Chicken_Primary_Macrophages_Infected_With_Attenuated_Salmonella_Typhimurium_Mutants/figures?lo=1
ВСА Среда Эндо Селенитовый бульон
Рис. 1. Результаты типирования S. enteritidis, выделенной на разных птицефабриках с помощью VNTR -ПЦР: 1. Голубь из кормоцеха. 2. Цыпленок-бройлер. 3. Суточный цыпленок до поступления на птицефабрику Рис. 2. Штаммы сальмонелл, выделяемые до (№ 1-7) и после (№ 8-23) смены кросса птицы на птицефабрике. Мультилокусное VNTR -типирование В данной ситуации мы использовали анализ микросателлитной ДНК с помощью ПЦР. Однако, во всем мире, кроме РФ, золотым стандартом идентификации штаммов сальмонелл является метод RFLP-PFGE. В России такое оборудование есть, но не используется… Основной тезис. Есть основания считать что глобальным фактором определяющим эпизоотическую ситуацию по сальмонеллезу является вертикальный путь заражения сальмонеллами от племенной птицы.
Какой вывод можно сделать протестировав 11 культур сальмонелл устойчивых к цефтриаксону?
Сальмонеллы могут сохраняться длительное время во внешней среде и продуктах питания. Ультрафиолетовое излучение и тепло ускоряет их смерть, они погибают при нагревании до 55 °C за полтора часа или до 60 °C в течение 12 минут[5]. Для защиты от заражения сальмонеллой рекомендуется подогревать пищу по крайней мере десять минут при 75 °C (167 °F). Сальмонеллы не погибают при замораживании. Что касается хранения продуктов питания, Белл и Кириакис (2002) обнаружили, что большинство сероваров сальмонеллы не растут при температуре ниже 7°С. C и pH ниже 4,5. Вессельс и др. (2021) показали оптимальные условия роста сальмонелл: температура от 5 до 46°C (оптимум 38°C), активность воды 0,94-0,99 и pH 3,8-9,5. Высокое содержание жира в корме или пище увеличивает вероятность заражения сальмонеллой, поскольку жир защищает бактерии во время прохождения через желудок. Дозы от 10 до 100 клеток сальмонеллы уже могут представлять серьезный риск (Университет Джорджии, 2015).
Белый понос, наиболее часто встречается у молодняка кур и индейки, но возможен и у взрослой птицы Выраженные патологические изменения в тканях кишечника, печени и сердца. А) Кишечник от здорового цыпленка B) Кишечник зараженного цыпленка. C) Кишечник после лечения бактериофагом. D) Печень от здорового цыпленка. E) Печень зараженного цыпленка f ) Печень обработанной курицы. G) Сердце от здорового цыпленка. H) Сердце зараженного цыпленка. https://www.researchgate.net/publication/323929007_Isolation_and_identification_of_Salmonella_pullorum_bacteriophage_YSP2_and_its_use_as_a_therapy_for_chicken_diarrhea/figures?lo=1 S. Gallinarum D1 1, 9, 12, -, - S. Pullorum D1 1, 9, 12, -, -
Общие данные по Salmonella enterica серотипу Choleraesuis у свиней. (A) Свинья 1. Слизистая оболочка толстой кишки гиперемирована (звездочка) с желтой фибринозной оболочкой. (Б) Свинья 2. Легкие. Неколлапсированные легкие с консолидированными краниовентральными долями и мультифокальными экхимозами (черные стрелки). (C) Свинья 2. Брыжеечные лимфатические узлы. Увеличенные и гиперемированные мезентериальные лимфатические узлы (черные стрелки).
грубые поражения после заражения Salmonella 4,[5],12:i:- и Salmonella Typhimurium, DPI 4, тяжелая диффузная форма фибринозный колит. Salmonella Свинья, инокулированная ( B) 4,[5],12 : i :-, DPI 4, тяжелый диффузный фибринозный колит. ( A) C винья, зараженная Typhimurium
![Salmonella enterica Серовара 4,[5],12:i:- Salmonella Typhimurium and Salmonella Derby, Enteritidis](https://s0.showslide.ru/s_slide/09dc/50ccff89-2c4b-48c9-9d9f-4a08b963fc29.jpeg "Сальмонелла: от рем.молодняка до мяса на прилавке")
Видовой состав микробиомов представителей сем. Lactobacillaceae от птицы с птицефабрик обладающих разным уровнем благополучия в отношении Salmonella spp.
Кривые роста флюоресценции при реалтайм ПЦР на наличие геномной ДНК сальмонелл. К+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Отрицательный контроль Анализ противоэшерихиозной активности лактобактерий изолированных от кур неблагополучнойй птицефабрики Отрицательный контроль К+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Анализ противосальмонеллезной активности лактобактерий изолированных от кур неблагополучнойй птицефабрики Средние концентрации ингибирующие рост и подвижность бактерий
Почему же сальмонеллы и микоплазмы столь неистребимы? Вывод – диагностика и мероприятия по ликвидации должны и начинаться с родительских форм и молодняка финального гибрида Численность птицы предрасположенной к заражению, но устойчивой к заболеванию снижается, инфицированность растет
1 2 3 4 5 6 Как оценить эффективность противосальмонеллезных мероприятий? Вариант 2 - Серологические исследования Средний титр в РА с антигенами сальмонелл разных серотипов, Log2 Процент серопозитивной птицы в РА к антигенам сальмонелл разных серотипов, % Реакция агглютинации с флюоресцентно -меченным антигеном S. infantis Использование серологических тестов на бройлерах – можно по разнице процента серопозитивной птиц и/или среднего титра между опытными и контрольными птичниками оценить эффективность противосальмонеллезных мероприятий за 10-14 дн до отбора проб крови 1:512 1:256 1:128 1:64 1:32 1:16 1:8
ПЦР мониторинг (20 проб клоакальных смывов или кишечного содержимого на птичник/возраст). Для птицы в возрасте до 20 дней следует сравнивать опытные и контрольные группы. Для птицы со сформировавшейся кишечной микробиотой и небольшим сроком эксперимента рациональнее сравнивать изменение инфицированности сальмонеллой до и после опыта на одной и той же птице. Варианты тестируемых проб А) клоакальные смывы (пред-обогащение на питательных средах) Б) кишечное содержимое (слепая кишка 0,1-0,2 мл). Можно зафиксировать спиртом Динамика инфицированности клоаки кур до и после использования окситетрациклина. ПЦР мониторинг.
Применение противосальмонеллезного бактериофага. Процент инфицированности
А Б В Рис.4 Фаговые бляшки вокруг зон задержки роста в присутствии антибиотиков: ципрофлоксацина (А), энрофлоксацина + триметоприма (Б), доксициклина (В). Применение противосальмонеллезного бактериофага. Процент инфицированности Основной тезис – бактериофаги хороши своей способностью к спонтанному распространению по птицефабрикам и свинокомплексам, что позволяет добиваться масштабного успеха при минимальных затратах и этот эффект наиболее характерен для крупных Российских агрохолдингов
ERIC PCR Дендрограмма группировки культур кишечной палочки и сальмонеллы по результатам фаготипирования. Цветная шкала – результат разделение на кластеры. Первая цифра – номер ветви, вторая цифра – номер кластера Зоны задержки роста к штамму S. enteritidis №25, мм
Праймеры со следующими последовательностями 5- AAATCTGGCCACGACGAATC -3 5- AATGCTCAAGAATCGCCTGC -3 Размер ампликона 366п.н. (пар нуклеотидов) Средняя частота встречаемости макролидфосфорилазы типа А - 21% у цыплят бройлеров Мы обнаружили этот ген у единичных штаммов сальмонелл серотипов Dublin, Infantis Схема антибиотикопрофилактики микоплазмоза в виде сочетания энрофлоксацина с тилозином в ряде случаев показала большую эффективность благодаря подавлению бактерий-продуцентов антибиотико-разрушающих ферментов Основной тезис – популяционный, микробиоценотический подход в изучении антибиотикорезистенотности очень важен, когда речь идет о ферментах инактивирующих антибиотики
Антибиотикочувствительность сальмонелл с эффлюксом и без эффлюкса, зоны задержки роста ( n =20), мм Оценка эффлюкса у культур сальмонелл в тесте с бромистым этидием Изменение антибиотикорезистентности после контакта с цитринином, М + SD мм Схема эффлюкс помпы
Как обеспечить адекватный контроль за наличием сальмонелл в продукции птицеводства ? Вероятно тут следует выработать рекомендации для государственных контролирующих органов Что необходимо для повышения эффективности противосальмонеллезных мероприятий в среднесрочной и долгосрочной перспективе Вероятно нужно выработать рекомендации что делать птицефабрикам в ситуации когда необходимо снизить уровень инфицированности птицы сальмонеллами
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!!!!
