1. Основные принципы регуляции метаболизма и скорости роста микроорганизмов 2. Регуляция на уровне биосинтеза белка 3. Регуляция активности ферментов 4. Регуляция интегральных мембранных процессов и клеточного деления у микроорганизмов 5. Промышленное использование микроорганизмов
Регуляция метаболизма – управление скоростью биохимических процессов путем обратимого изменения количества белковых посредников, участвующих в этих процессах, или их активности. В большинстве биохимических процессов белковые посредники - катализаторы химических реакций – ферменты. Однако некоторые процессы (транспорт многих субстратов через биологические мембраны) осуществляются белками, которые не катализируют каких-либо химических превращений, а обусловливают «узнавание» и транслокацию субстратов.
Существует 2 основных уровня регуляции: 1) уровень регуляции биосинтеза белков-ферментов, 2) уровень регуляции их активности в процессе функционирования. Этапы регуляции биосинтеза белковых посредников: подготовительные стадии: репликация генома и его транскрипция, т. е. биосинтез иРНК; завершающая стадия – трансляция – сборка молекул белков ферментов, конечных акцепторов генетической информации клетки.
РЕГУЛЯЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ ДНК (полуконсервативный механизм), состоящей из инициации, элонгации, терминации. Характеризуется мультиферментным характером (участие 2х ДНК-полимераз, ДНК-лигазы, релаксирующих белков – хеликазы и топоизомераз ). У бактерий одновременно протекают репликации нескольких типов : 1) редупликация генома; 2) репарационный синтез ДНК; 3) рекомбинационный синтез ДНК; 4) репликация внехромосомных генетических детерминант – плазмид. Репликация ДНК находится под «+» (накопление активатора активирует репликацию согласованно с удвоением массы клетки) и «–» контролем белков-регуляторов.
а) путем индукции и репрессии, в которой участвуют белковые репрессоры – продукты генов-регуляторов. Синтез конститутивых белков не зависит от субстратов или продуктов. Синтез индуцибельных белков резко ускоряется в присутствие их субстратов ( индукция ). Уровень других белков сильно снижается при избытке конечного продукта – репрессия. По типу индукции регулируется синтез белков, участвующих в катаболизме, по типу репрессии – белков анаболизма.
В случае индуцибельных белков репрессор, кодируемый геном-регулятором, блокирует транскрипцию структурных генов, взаимодействующих с операторным участком ДНК в отсутствие индуктора (субстрата), а соединяясь с индуктором, репрессор инактивируется. В случае репрессибельных белков репрессор не активен и не препятствует транскрипции, а, взаимодействуя с конечным продуктом метаболического пути ( корепрессором ), приобретает способность присоединяться к оператору и блокировать транскрипцию структурных генов
б) катаболическая репрессия – регуляция активности оперонов, транскрипция которых нуждается в наличии активатора – комплекса специального белка с АМФ. в) регуляция на уровне функционирования РНК-полимеразы. г) регуляция путем изменения конформации или структуры ДНК ( топоизомеразы – белковые катализаторы, изменяющие степень суперспирализации ДНК: релаксирующие белки снижают, а ДНК-гираза повышает ее ).
3. Регуляция трансляции: а) регуляция на уровне биосинтеза и сборки компонентов аппарата трансляции: аминоацетил-тРНК-синтетазы ; тРНК, рРНК, мРНК, рибосомных белков и белковых факторов трансляции. б) регуляция функционирования аппарата трансляции ( селективность рибосом в отношении мРНК ). 4. Регуляция биосинтеза белков путем посттрансляционной модификации ( стадия «созревания» или процессинга белков; ферментативное присоединение коферментов – биотина, флавина ; формирование третичной и четвертичной структур молекул ). 5. Регуляция круговорота белков путем избирательного протеолиза.
Более быстро действующий уровень, чем регуляция биосинтеза белков. Оба способа управления метаболизмом дополняют друг друга. Путем обратимой ковалентной модификации (обратимая), например, регуляция активности глутаматсинтетазы у Г – прокариот путем ее обратимого аденилирования ( фермент состоит из 12 субъединиц, каждая из которых может присоединять АМФ к остатку тирозина ).
2. Путем взаимодействия с субстратом (гомотропная кооперативность ): фермент имеет несколько активных центров одинаковой природы, взаимодействующих с молекулами субстрата, причем присоединение первой молекулы субстрата облегчает присоединение последующих молекул (НАД+-зависимая глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа из дрожжей).
3. Путем взаимодействия с продуктом (гетеротропная кооперативность) : фермент обладает раздельными активными центрами: каталитический связывает субстрат и регуляторный, связывающий продукт или другой эффектор; обычно эти центры размещены на разных субъединицах фермента. Связывание эффектора с регуляторным центром влияет на конформацию каталитического центра и снижает его сродство к субстрату (например, активность треониндегидратазы у E. coli подавляется конечным продуктом метаболической цепи – изолейцином). Этот тип регуляции характерен для конструктивных (анаболических) путей метаболизма: конечный продукт метаболического пути, накапливающийся до определенного уровня, подавляет свой биосинтез, ингибируя активность первого фермента данного пути, что обеспечивает экономию конструктивного материала и энергии.
В катаболических (энергетических) реакциях «–» эффектором для ферментов служит АТФ, а «+» эффектором – АМФ и АДФ. Поэтому активность ферментов определяется общим «энергетическим зарядом» клетки: Энергетический заряд = АТФ + ½ АДФ / АТФ + АДФ + АМФ Ферменты конструктивного и энергетического метаболизма – амфиболические ферменты.
4. Путем пространственного разобщения и взаимодействия с мембранами : (у Г– бактерий некоторые гидролазы локализованы в периплазме → активность фермента регулируется путем управления скоростью проникновения или его выхода – компартментация). Многие ферменты могут обратимо взаимодействовать с клеточной мембраной, что изменяет их физико-химические свойства и активность – аллотопия. Ферменты, катализирующие серию последовательных реакций, образуют ансамбли, локализованные в ЦПме ( дегидрогеназы α-кетокислот ) или в клеточной мембране ( дыхательные ферменты ).
Организация и регуляция транспортных процессов Основную роль в транспорте веществ из окружающей среды в клетки большинства микроорганизмов выполняют компоненты аппарата, локализованного в ЦПМ е. Клетки Г – микроорганизмов окружены наружной мембраной – барьером для проникновения большинства гидрофильных (и некоторых гидрофобных) веществ. Избирательная проницаемость наружно мембраны обеспечивается образованием гидрофильных «каналов», или «пор», с помощью специальных структурных белков (поринов), а Также специфическими транспортными системами.
Модель «подвижного» переносчика : интегральный мембранный белок ( пермеаза ), образующий гидрофобный комплекс с гидрофильным субстратом, который поступает путем диффузии на внутреннюю сторону мембраны, где субстрат освобождается во внутриклеточное пространство По этому типу осуществляется транспорт ионов некоторыми ионофорами (валиномицином, моненсином).
2. Наличие в мембране гидрофильного «канала», через который могут проникать гидрофильные субстраты. В отличие от малоспецифичного канала, образуемого поринами во внешней ембране, стереоспецифичность транслокации субстратов через ЦПМу, вероятно, достигается путем «эстафетной» передачи молекул субстрата от одной функциональной группы, «выстилающей» внутреннюю поверхность канала, к другой. Субстрат как ключ открывает предназначенный для него канал.
3. Комбинация первых 2х моделей : позволяет использовать их «+» стороны: предполагается наличие гидрофобного мембранного переносчика, который путем конформационных изменений, вызываемых субстратом, «протаскивает» последний с внешней стороны мембраны на ее внутреннюю сторону. Упрощенный вариант модели - представление о переносчике как о трансмембранном «колесе», вращающемся в мембране и захватывающем субстрат на ее внешней стороне. Образующийся гидрофобный комплекс распадается на внутренней стороне мембраны.
В состав мембранных транспортных систем входит более одного белкового посредника, между ними существует разделение функций. Сами переносчики организованы в виде мультимеров (димеров). Связывающие белки не могут выполнять функции переносчиков, т.к. они являются гидрофильными периферическими белками, а не интегральными компонентами мембраны. Их роль: «узнавание» субстрата, концентрирование его на внешней поверхности мембраны и последующая передача компоненту, осуществляющему транслокацию субстрата через мембрану. Связывающие белки участвуют в хемотаксисе.
2 основных типа транспортных систем: 1) 2-3 белковых посредника, из которых один – истинный транслокатор (переносчик), а другие, располагаясь на внешней и внутренней поверхности мембраны, определяют специфичность транспорта и способы его регуляции. лишь один белковый посредник, обязательное его свойство – сложность четвертичной структуры ( мультимерность ), приводящее к появлению аллостерических свойств, определяющих взаимодействия с субстратом и эффекторами. Такие системы осуществляют симпорт, т.е. одновременную транслокацию субстрата и эффекторов, в качестве которых выступают одновалентные неорганические катионы (Н + или N а + ). Системы 1-го типа используют АТФ (или близкие к нему интермедиаты), энергизация транспортных систем 2-го типа - за счет трансмембранного электрохимического потенциала.
Осуществляется на двух уровнях: на уровне биосинтеза белковых переносчиков и на уровне функционирования готовых посредников. У микроорганизмов для одного и того же субстрата часто используется несколько транспортных систем. Часть систем обладает узкой специфичностью и предназначена для группы субстратов (иногда для единственного субстрата), близких по химическому строению, а часть систем обладает более широкой субстратной специфичностью. У Е. со li существует 12 типов транспортных систем аминокислот, причем узкоспецифичные транспортные системы часто обладают более высоким сродством к субстрату, чем системы с широкой специфичностью.
Процесс клеточного роста и деления включает: накопление «критической» клеточной массы (объема), индуцирующей деление; 2) репликация ДНК генома; 3) построение новой клеточной оболочки (клеточной стенки и ЦПМы), обеспечивающее рост клетки; 4) построение клеточной перегородки — собственно деление; расхождение дочерних клеток. Некоторые из этих событий протекают одновременно, другие совершаются последовательно ; некоторые из них могут отсутствовать у данного микроорганизма. Например, деление клеток может осуществляться без участия клеточной стенки (у порядка М ycoplasmatales, L -форм некоторых бактерий; может отсутствовать этап расхождения дочерних клеток ( Streptococcales, Sarcina ).
Осуществляется на 2х уровнях: путем регуляции каждого из перечисленных процессов, путем организации их взаимодействия. Накопление критической клеточной массы и репликация ДНК. Это подготовительный этап к процессу собственно деления клетки. В различных условиях размер клеток (и пороговая биомасса) у данного организма может варьировать, но в стандартных условиях этот признак стабилен и даже имеет определенное таксономическое значение. Построение новой клеточной оболочки. Различают пролиферацию данных клеточных структур (динамику накопления в них нового материала на протяжении клеточного цикла), и сегрегацию поверхностных структур (способ включения нового материала в предсуществующие структуры).
В период подготовки к клеточно му делени ю происходит запасание предобразованных белков в цитоплазме и быстрая их мобилизация в процессе деления. В период деления возрастает активность некоторых литических ферментов (в частности, муреингидролаз), участвующих в образовании брешей в предсуществующем каркасе клеточной стенки, необходимых для включения новых ее фрагментов.
Завершает клеточный цикл. В раскрытии механизмов регуляции этого цикла важный вклад внесло изучение специфических мутантов, из которых наибольшую ценность представляют «условные» мутанты, у которых процесс протекает нормально при обычных физиологических условиях ( пермиссивных условиях ), а при непермиссивных условиях (повышенная температура, действие радиации) процесс подавляется. Иногда мутация приводит к появлению зависимости клеточного деления от дополнительных факторов.
В норме репликация ДНК должна завершаться до построения клеточной перегородки, чтобы каждая из дочерних клеток получила полный набор генетических детерминант. Поэтому в процессе эволюции выработались определенные сигналы для запуска ( инициации ) ключевых процессов. Между рассматриваемыми процессами не существует облигатно-реципрокной связи, при которой подавление одного из процессов тормозило бы другой, и наоборот. Сайты, ответственные за построение перегородки, строго локализованы в поверхностных структурах клетки, а количество перегородок пропорционально количеству удвоений клеточной массы. Сигналом для инициации сборки клеточной перегородки в норме служит удвоение клеточной массы (объема).
Промышленная микробиология основывается на применении микроорганизмов в промышленности для получения коммерчески ценных продуктов и лекарств: антибиотики, ферменты, ингибиторы ферментов, витамины, ароматизаторы, добавки для пищевой промышленности. Гибкость метаболизма и высокая способность микробов к адаптации, простота культивирования, изученность генетики, разработанные методы направленного создания штаммов с заданными свойствами – преимущества, делающие микробную биотехнологию одним из перспектив ных направлений промышленности.
Определяется такими факторами, как высокий выход продукта (образование больших количеств и исходного материала), низка стоимость производства и доступность сырья. В настоящее время разработаны способы получения более 1000 Наименований продуктов, полученных биотехнологическими способами. В США совокупная стоимость этих продуктов в 2000 г. оценивается в десятки миллиардов $. Все отрасли, в которых может быть использована биотехнология, перечислить невозможно.
управляемое культивирование (изменение состава питательной среды, целевые добавки, регуляция скорости перемешивания, аэрации, модификация температурного режима); генетические манипуляции, которые подразделяют на традиционные методы (селекция штаммов) и методы генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). Микробиологическим путём получают микробную биомассу, первичные и вторичные продукты метаболизма. Первичные продукты (продукты 1-ой фазы) — метаболиты, синтез которых необходим для выживания данного микроорганизма. Синтез вторичных продуктов (продукты 2-ой фазы) не относится к жизненно необходимым для микроорганизма-продуцента.
Производство продуктов микробного синтеза – одно из самых развитых направлений современной промышленности. Многие проблемы медицины, пищевой промышленности, сельского хозяйства решаются с применением организмов с модифи цированным геномом. С 1982 г. ряд фирм Европы, США и Японии производят инсулин человека, выделяемый из культуральной жидкости кишечной палочки. Из 1000 бактериальной культуры получают около 200 г человеческого инсулина. Такое количество ранее получали из 1600 кг тканей поджелудочной железы животных. Новый продукт позволяет избежать развития аллергических реакций на животный инсулин. В 2000 г. стоимость продукции, выпускаемой в США на основе генно - инженерных методов, достигла 50 млрд. $. Инсулин
1. Медицина, здравоохранение, фармакология: антибиотики, ферменты, аминокислоты, кровезаменители, алкалоиды, нукпеотиды, иммунорегуляторы, противораковые и противовирусные препараты, новые вакцины, гормональные препараты (инсулин, гормон роста), моноклональные AT для диагностики и лечения, пробы ДНК для диагностики и генотерапии, продукты диетического питания.
2. Получение химических веществ: этилен, пропилен, бутилен, окисленные углеводороды, органические кислоты, терпены, фенолы, акрилаты, полимеры, ферменты, продукты тонкого органического синтеза, полисахариды.
3. Животноводство: усовершенствование кормовых рационов (производство белка, аминокислот, витаминов, кормовых антибиотиков, ферментов, заквасок для силосования), ветеринарных препаратов (антибиотики, вакцины), гормонов роста, манипуляции с чужеродными генам.
4. Растениеводство: биорациональные пестициды, бактериальные удобрения, гибберелины, производство безвирусного посадочного материала, создание введение генов устойчивости к болезням.
5. Рыбное хозяйство: кормовой белок, ферменты, антибиотики.
6. Пищевая промышленность: белок, аминокислоты, заменители сахара (аспартам, глюкозофрукто вый сироп), полисахариды, органические кислоты, нуклеотиды, липи ды, переработка пищевых продуктов.
7. Энергетика и добыча полезных ископаемых: спирты, биогаз, жирные кислоты, алифатические углеводороды, водород, интенсификация добычи нефти, газа, искусственный фотосинтез, биометаллургия, добыча серы.
8. Тяжёлая промышленность: улучшение технических характеристик каучука, моторных топлив; антикоррозийные присадки, смазки для проката чёрных и цветных металлов, технический белок, липиды.
9. Лёгкая промышленность: улучшение технологии переработки кож, производства текстильного сырья, шерсти, бумаги, парфюмерно-косметических изделий, получение биополимеров, искусственных кожи и шерсти и т.д.
10. Биозлектроника : биосенсоры, биочипы
11. Космонавтика : создание замкнутых систем жизнеобеспечения в космосе.
12. Экология: утилизация сельскохозяйственных, промышленных и бытовых отходов, биодеградация трудноразлагаемых и токсических веществ ( пестици дов, гербицидов, нефти), создание замкнутых технологических циклов, производство безвредных пестицидов, легкоразрушаемых полимеров.
13. Научные исследования: генно-инженерные и молекулярно-биологические исследования ( ферменты рестрикции ДНК, ДНК- и РНК-полимеразы, ДНК- и РНК-лигазы, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды), медицинские исследования (средства диагностики, реактивы), химия (реактивы, сенсоры).
