Ферменты 2. ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава РФ Кафедра биохимии Екатеринбург, 2015г Дисциплина: Биохимия Лектор: Гаврилов И.В. Факультет: лечебно-профилактический, Курс: 2
Кинетика ферментативных реакций. Регуляция скорости ферментативных реакций. Клеточная сигнализация
Энзимология – наука, изучающая ферменты
1. Кинетика ферментативных реакций Кинетика ферментативных реакций -направление энзимологии, исследующее влияния реагирующих веществ (субстраты, продукты, ингибиторы, активаторы и т.д.) и условий (рН, t °, давление ) на скорость ферментативной реакции.
Для объяснения высокой специфичности ферментов по отношению к субстратам Эмиль Фишер в 1894г выдвинул гипотезу о строгом соответствии геометрической формы субстрата и активного центра фермента. 1. Модель «ключ – замок» Р1 Р2 + + E+S ES E Теории о специфичности действия ферментов
2. Теория «индуцированного соответствия» A B C S E B A C ES Теория индуцированного (вынужденного) соответствия Дениеля Кошланда (1959г): полное соответствие фермента и субстрата наступает лишь в процессе их взаимодействия: Субстрат индуцирует необходимые конформационные изменения фермента, после чего они соеденяются. Теория основана на данных кинетического анализа, изучением фермент-субстратных комплексов методами ренгено-структурного анализа, спектрографии и кристаллографии и др. Существует не только геометрическое, но и электростатическое соответствие S S
При взаимодействии фермента и субстрата оба подвергаются модификации и подстраиваются друг под друга. Возникающие в субстрате изменения способствуют превращению его в продукт. A B C E B A C ES S S 3. Теория «индуцированного соответствия» (современные представления)
S E ES при взаимодействии фермента E с субстратом S образует комплекс ES *, в котором реакционная способность субстрата выше, чем в нативном состоянии. Через ряд промежуточных соединений происходит превращение субстрата в продукт реакции Р ES * P E EP * Теория переходных состояний (промежуточных соединений)
Кислотно-основные реакции –в активном центре фермента находятся группы -СОО - и - N Н 3 +, которые способны присоединять и отдавать Н. Реакции присоединения (отщепления, замещения) электрофильные, нуклеофильные – в активном центре фермента находятся гетероатомы смещающие электронную плотность. Окислительно-восстановительные реакции – в активном центре фермента находятся атомы, имеющую разную электроотрицательность Радикальные реакции. При ферментативном катализе реализуются те же механизмы, которые возможны без участия ферментов:
Ферменты снижают энергию активации Скорость химической реакции зависит от концентрации реагирующих веществ В комплексе с ферментами субстраты превращаются в более устойчивые промежуточные соединения, за счет чего их концентрация резко повышается, что способствует ускорению реакции
S E ES ES * P E EP * S S * P * Ферментативная реакция Неферментативная реакция
ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ БАРЬЕР РЕАКЦИИ – кол-во энергии, которое необходимо молекуле, чтобы вступить в химическую реакцию. ЭНЕРГИЯ АКТИВАЦИИ - кол-во энергии, которое необходимо сообщить молекуле для преодоления энергетического барьера.
Свободная энергия системы Ход реакции Исходное состояние Конечное состояние Энергия активации катализируемой реакции Энергия активации некатализируемой реакции S P S* ES*
1) 2Н 2 О 2 2Н 2 О + О 2 Каталаза Энергия активации : 1. В спонтанной реакции – 18 ккал/моль 2. При использовании катализатора Fe 2+ – 12 ккал/моль 3. В присутствии фермента каталазы – 5 ккал/моль Свободная энергия системы Ход реакции 1. 2. 3. Энергия активации
[S] Vmax Концентрация фермента - константа Кинетика ферментативных реакций
Зависимость скорости реакции от концентрации фермента концентрация фермента V Концентрация субстрата – константа
Повышение температуры на 10 градусов повышает скорость химической реакции в 2-4 раза. При повышение температуры фермент подвергается денатурации и теряет свою активность.
Количество активного фермента Скорость ферментативной реакции Скорость реакции активного фермента
Изменение концентрации Н + меняет химический состав фермента, его строение и каталитическую активность. Изменение концентрации Н + меняет химический состав субстрата, его строение и способность вступать в ферментативную реакцию. Денатурацией фермента при очень высоких или очень низких рН.
Km – концентрация субстрата [S], при которой скорость ферментативной реакции V равна половине от максимальной
Vmax [S] V = —————- Km + [S] V – скорость реакции Vmax – максимальная скорость реакции Km – константа Михаэлиса [S] – концентрация субстрата Уравнение скорости ферментативной реакции
Реакции ингибирования ферментативных процессов ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ I. Обратимое II. Необратимое Конкурентное Неконкурентное Бесконкуренетное Смешанного типа Для определения обратимости ингибирования проводят диализ среды, где есть фермент и ингибитор. Если после диализа восстанавливается активность фермента, то ингибирование обратимое
Варианты взаимодействия ингибитора с ферментом Блокируют активный центр фермента Меняют четвертичную структуру фермента Соединяются с коферментом, активатором Блокируют часть фермента, соединяющуюся с коферментом Нарушают взаимодействие фермента с субстратом Вызывают денатурацию фермента (неспецифические ингибиторы) Связываются с аллостерическим центром
Конкурентный тип ингибирования Осуществляется веществом, близким по химическому строению к субстрату V max V [S] V max / 2 Km K м i
Ингибитор реагирует с ферментом иным образом, чем субстрат, поэтому повышение концентрации субстрата не может вытеснить ингибитор и восстановить активность фермента V max V [S] V max Km V max V max Неконкурентный тип ингибирования
S P E * S Кофермент Витамин P Клетка
Транспорт веществ через мембрану Диффузия СО 2, О 2 Облегченная диффузия Н 2 О, глюкоза АТФ АДФ + Фн Первично- активный транспорт Na + K + Вторично- активный Транспорт Органич. молекулы Клетка антипорт Пассивный Активный
Гепатоцит Глюкоза Коферменты Витамины Адипоциты, миоциты Глюкоза ГЛЮТ-4 Инсулин Ферменты ГЛЮТ-4 ПВК Коферменты E 1, Е2, Е3…
Регуляция каталитической активности ферментов бывает: 1). Неспецифической. Каталитическая активность всех ферментов зависит от температуры, рН и давления. 2). Специфической. Под действием специфических активаторов и ингибиторов изменяется активность регуляторных ферментов, которые контролируют скорость метаболических процессов в организме.
Механизмы специфической регуляции каталитической активности ферментов: 1). Аллостерическая регуляция; 2). Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий; 3). Регуляция через ковалентную модификацию. а). Регуляция путем фосфорилирования/дефосфорилирования фермента; б). Регуляция частичным протеолизом.
Аллостерическими называют ферменты, активность которых регулируется обратимым нековалентным присоединением модулятора (активатора и ингибитора) к аллостерическому центру. S A B C P E 1 E 2 E 3 E 4 Активирование происходит по принципу прямой положительной связи, а ингибирование - по принципу отрицательной обратной связи. Активность аллостерических ферментов изменяется очень быстро
а). Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков. АЦ G АЦ G АТФ цАМФ б). Регуляция каталитической активности ферментов ассоциацией/диссоциацией протомеров цАМФ R R C цАМФ C R R C цАМФ S P C S P ПК А цАМФ
Регуляция активности фермента осуществляется в результате ковалентного присоединения или отщепления от него фрагмента. Бывает 2 видов: а). путем фосфорилирования и дефосфорилирования ферментов;. б). путем частичного протеолиза ферментов (внеклеточные) Субстрат Продукт Трипсиноген Трипсин
III. Механизмы регуляции количества ферментов Индукторы - это вещества которые запускают синтез ферментов Процесс запуска синтеза ферментов называется индукцией Ферменты, концентрация, которых зависит от добавления индукторов, называются индуцируемыми ферментами Ферменты, концентрация которых постоянна и не регулируется индукторами, называются конститутивными ферментами Базовый уровень - это концентрация индуцируемого фермента при отсутствии индуктора. Фермент Аминокислоты Аминокислоты биосинтез гидролиз Индукторы Репрессоры
Репрессоры (точнее корепрессоры ) - вещества, которые останавливают синтез ферментов. Процесс остановки синтеза ферментов называется репрессией. Дерепрессией – называется процесс возобновления синтеза ферментов после удаления из среды репрессора В качестве индукторов и репрессоров выступают некоторые метаболиты, гормоны и биологически активные вещества.
В многоклеточных организмах поддержание гомеостаза обеспечивают 3 системы: 1). Нервная 2). Гуморальная 3). Иммунная Регуляторные системы функционируют с участием сигнальных молекул. Сигнальные молекулы – это вещества, которые переносят информацию. Для передачи сигнала: А). ЦНС использует нейромедиаторы Б). Гуморальная система использует гормоны В). Иммунная система использует цитокины.
Гормоны - это сигнальные молекулы беспроводного системного действия Истинные гормоны в отличии от других сигнальных молекул: синтезируются в специализированных эндокринных клетках, транспортируются кровью действуют дистантно на ткани мишени. Гормоны по строению делятся: на белковые (гормоны гипоталамуса, гипофиза, поджелудочной железы), производные аминокислот (из тирозина тиреоидные гормоны, катехоламины) стероидные (половые, кортикоиды). Пептидные гормоны и катехоламины растворимы в воде, они регулируют преимущественно каталитическую активность ферментов. Стероидные и тиреоидные гормоны водонерастворимы, они регулируют преимущественно количество ферментов.
Гормоны регулируют количество и каталитическую активность ферментов не напрямую, а опосредовано через каскадные системы Каскадные системы Каскадные системы: Многократно усиливают сигнал гормона (повышают количество или каталитическую активность фермента) так что 1 молекула гормона способна вызвать изменение метаболизма в клетке Обеспечивают проникновение сигнала в клетку (водорастворимые гормоны в клетку самостоятельно не проникают) Гормоны Ферменты Каскадные системы х 1000000
каскадные системы состоят из: рецепторов ; регуляторных белков ( G -белки, IRS, Shc, STAT и т.д.). вторичных посредников ( messenger - посыльный) (Са2+, цАМФ, цГМФ, ДАГ, ИТФ); ферментов (аденилатциклаза, фосфолипаза С, фосфодиэстераза, протеинкиназы А, С, G, фосфопротеинфосфотаза); Виды каскадных систем: аденилатциклазная, гуанилатциклазная, инозитолтрифосфатная, RAS и т.д.),
По эффекту рецепторы делятся на: активаторные (активируют каскадные системы) ингибиторные (блокируют каскадные системы). Рецепторы - это белки, встроенные в клеточную мембрану или находящиеся внутри клетки, которые, взаимодействуя с сигнальными молекулами, меняют активность регуляторных белков. По локализации рецепторы делятся на : цитоплазматические; ядерные; мембранные. По механизму передачи сигнала рецепторы делятся на 4 типа: 1). Рецепторы, связанные с ионными каналами 2). Рецепторы, с ферментативной активностью. Бывают 3 видов: а). Рецепторы, с тирозинкиназной активностью (тирозиновые протеинкиназы). б). Рецепторы, с фосфатазной активностью (тирозиновые протеинфосфотазы) (например, ФПФ). в). Рецепторы с гуанилатциклазной активностью (ГЦ). 3). Рецепторы, сопряженные с G -белками по строению их еще называют серпантинными. 4). Ядерные и цитоплазматические рецепторы.
Работа рецептора связанная с G- белком (серпантинный)
Рецептор с ферментативной активностью (тирозинкиназный)
Аденилатциклазная система ПК А Фермент неакт Фермент акт АТФ АДФ Ф субстрат продукт Цитоплазматическая мембрана A Ц Г АТФ цАМФ цитоплазма ПК А* R G Гормоны: Глюкагон, Вазопресин, Катехоламины (через β 2-адренэргические рецепторы) Гормоны гипофиза (АКТГ, ЛДГ, ФСГ, ЛТ, МСГ, ТТГ), паратгормон, Фактор роста нервов PGE 1 Имеются α- и β-адренергические рецепторы в плазматических мембран клеток печени, мышц и жировой ткани.
Гуанилатциклазная система Сигнальные молекулы: ПНФ (расслабление тонуса сосудов), Катехоламины (через α -адренэргические рецепторы) Бактериальный эндотоксин (блокирует всасывание воды вызывает диарею) NO, продукты ПОЛ (цитоплазматическая ГЦ) ПК G Фермент неакт Фермент акт АТФ АДФ Ф субстрат продукт Цитоплазматическая мембрана ГЦ Г ГТФ цГМФ цитоплазма ПК G * Гуанилатциклазная система функционирует в легких, почках, эндотелии кишечника, сердце, надпочечниках, сетчатке и др. Она участвует в регуляции водно-солевого обмена и тонуса сосудов, вызывает релаксацию и т.д.
Инозитолтрифосфатная система Фермент неакт Фермент акт субстрат продукт Цитоплазматическая мембрана ФЛ С Г ФИФ 2 ПК С цитоплазма R G Гормоны: гонадолиберин, тиролиберин, дофамин, тромбоксаны А2, эндоперекиси, лейкотриены, агниотензин II, эндотелин, паратгормон, нейропептид Y, адренергические катехоламины (через α1 рецепторы), ацетилхолин, брадикинин, вазопрессин (через V 1 рецепторы). ИТФ ДГ Кальмодулин -4Са 2+ Кальмодулин Кальмодулин -4Са 2+ субстрат продукт Са 2+ Са 2+
Г белок белок Транскрипция мРНК ДНК Трансляция мРНК ЯДРО Цитоплазматическая мембрана субстрат продукт цитоплазма ЦПР ЦПР Г Г Г ЦПР Фермент Трансмембранная передача информации с участием цитоплазматических рецепторов рибосома Гормоны: Кортикоиды, половые, тиреоидные шаперон шаперон
