1
Строение ДНК и РНК 2. Генетический код и его свойства 3. Репликация ДНК 4. Защита искажения генетической информации на уровне ДНК, или репарация ДНК 2
Структура молекулы ДНК была расшифрована в 1953 г. Джеймсом Уотсоном, Френсисом Криком, Морисом Уилкинсом / Нобелевская премия по физиологии и медицине 1962 г. Ф. Крик и Д. Уотсон Ф. Крик и Д. Уотсон возле модели ДНК http://www.diletant.ru/articles/13604722 3
ДНК представляет собой двуспиральную антипараллельную комплементарную структуру. http://serebniti.ru/forum/viewtopic.php?f=14&t=457&start=180&view=print 4
В основу постулата о комплементарной двуспиральной структуре были положены правила Чаргаффа : Количество аденина равно количеству тимина ; а гуанина – количеству цитозина ; 2. Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Ц+Т А+Г=Ц+Т 5
Мономерами ДНК являются нуклеотиды, в состав каждого входят: http://www.apologetica.ru/kniga2/DNK_belok_kletka_mikromir.html http://medbiol.ru/medbiol/biology_sk/00015d50.htm 6
http ://www.alliot.fr/bio.shtml.fr 7
Отличия РНК от ДНК : 1) вместо дезоксирибозы в состав нуклеотидов РНК входит пятиуглеродный сахар — рибоза; 2) вместо азотистого основания тимина – урацил; 3) молекула РНК обычно представлена одной цепочкой (у некоторых вирусов – двумя); 4) молекулы ДНК могут быть кольцевыми (прокариоты) и линейными, РНК – линейные, либо тРНК – форма клеверного листа 8 Признак ДНК РНК САХАР дезоксирибоза рибоза АЗОТИСТЫЕ ОСНОВАНИЯ А Т Г Ц А У Г Ц КОЛ-ВО ЦЕПЕЙ В МОЛЕКУЛЕ 99,99% двойная спираль 99,99% одноцепочечная ФОРМА МОЛЕКУЛЫ Большинство двуцепочечные – линейные, часть - кольцевые Линейные молекулы или в форме клеверного листа
http://harunyahya.com/en/Books/9642/if-darwin-had-known-about/chapter/4678 9
10 http://arstechnica.com/uncategorized/2008/12/journal-requires-peer-reviewed-wikipedia-entry-to-publish/ http://www.microbe.net/fact-sheet-ribosomal-rna-rrna-the-details/ Виды РНК Размер в нуклеотидах (число пар) mRNA – и(м) РНК 100-100000 tRNA – тРНК 70-90 rRNA – рРНК Несколько дискретных классов от 100 до 500000 siRNA – малые РНК 100-300 http://www.creative-biogene.com/Product/MicroRNA http://www.dddmag.com/products/2010/07/lentiviral-micrornas
Система записи генетической информации в ДНК (и-РНК) в виде определенной последовательности нуклеотидов называется генетическим кодом. В 1968 году Р. Холли, М. Ниренберг, Х. Хоране получили Нобелевскую премию за открытие и интерпретацию генетического кода и его роль в белковом синтезе. 11
Триплетность 2. Коллинеарность 3. Специфичность 4. Неперекрываемость 5. Универсальность 6. Вырожденность (избыточность) 7. Однонаправленность 12
Репликация молекулы ДНК – это процесс образования идентичных копий ДНК, осуществляемый комплексом ферментов и структурных белков. Репликация ДНК лежит в основе: Воспроизведения генетической информации при размножении живых организмов Передачи наследственных свойств из поколения в поколение Развития многоклеточного организма из зиготы 13 http://volgadog.ru/viewtopic.php?id=4260
1. Комплементарность - пространственная взаимодополняемость (взаимное соответствие) поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящая, как правило, к образованию вторичных водородных связей между ними. Комплементарность проявляется в структуре двуспиральных ДНК и РНК, где две полинуклеотидные цепи образуют в результате комплементарного взаимодействия пар пуриновых и пиримидиновых оснований (А-Т, Г-Ц) двуспиральную молекулу. 14 http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_medicine/20577/ Нуклеиновые
2. Антипараллельность - противоположная направленность двух нитей двойной спирали ДНК; одна нить имеет направление от 5' к 3', другая - от 3' к 5'. Каждая цепь ДНК имеет определенную ориентацию. Один конец несет гидроксильную группу (- ОН ), присоединенную к 3'-углероду в сахаре дезоксирибозе, на другом конце цепи находится остаток фосфорной кислоты в 5'-положении сахара. Две комплементарные цепи в молекуле ДНК расположены в противоположных направлениях - антипараллельно: одна нить имеет направление от 5' к 3 ', другая - от 3' к 5'. При параллельной ориентации напротив 3'-конца одной цепи находился бы З'-конец другой. 15 http://www.biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Part25-141.html
3. Полуконсервативность Две цепи исходной молекулы ДНК расходятся вследствие разрыва слабых водородных связей между азотистыми основаниями. Каждая из них служит матрицей для образования новой цепи ДНК, а возникающие между азотистыми основаниями водородные связи соединяют старую и новую цепи, восстанавливая целостность молекулы. В результате каждая новая клетка получает гибридную молекулу ДНК, состоящую из одной старой и одной новой цепи. 16 http://medbiol.ru/medbiol/biology_sk/00038061.htm консервативный полуконсервативный дисперсный
4. Двунаправленность - в каждой точке начала репликации формируются две репликационные вилки, которые движутся в противоположных направлениях. Продвижение вилки прекращается, когда она столкнется с репликационной вилкой соседнего репликона. http ://medicalplanet.su/genetica/68.html MedicalPlanet 17
5. Согласованность репликации и клеточного цикла Репликация молекулы ДНК происходит в S период интерфазы 18 http://biochemistry.ru/biohimia/files/assets/basic-html/page57.html
Участок молекулы ДНК от точки начала одной репликации до точки начала другой называется репликоном. Бактериальная хромосома содержит один репликон. dartideas.ru http://www.rusdocs.com/replikaciya-dnk-i-kletochnoe-delenie
Эукариотическая хромосома содержит много репликонов. Репликация ДНК эукариотической хромосомы. Показан один из многих репликонов. Репликативные вилки движутся в противоположных направлениях от точки начала репликации Каждая эукариотическая хромосома - полирепликон 20 http://elementy.ru/news/431163 http://groh.ru/gro/lewin/levin38.html http://www.vitaeauct.narod.ru/005/grnt/2600.htm
Репликация начинается в точке « origin » (начало репликации) У бактерий в кольцевом геноме имеется только одна точка « origin », тогда как у эукариотических хромосом их множество Репликон - участок ДНК между двумя « ориджинами » репликации. 21 Точка ori Точка ori Точка ori Точка ori
22 Репликация у эукариот начинается на хромосоме во многих точках «origin»-репликации Так как геномы эукариот состоят из большого числа самостоятельных репликонов, суммарное время репликации отдельной хромосомы значительно сокращается.
Репликоны у эукариот распределены в геноме не случайно, они расположены группами ( replicon foci ). В этих группах собираются ферменты репликации, которые удлиняют вилки репликации одновременно 10-100 соседних репликонов длиной примерно по 100тпн каждый. Репликация в них завершается за 45–60 мин. Кроме этого существуют очень длинные репликоны (более 1000тпн) – столь большие, что репликация в них продолжается по нескольку часов. 23 Организмы Число репликонов Средняя длина репликонов (тысяч пар нуклеотидов) Скорость движения репликативной вилки (т.п.н.) Бактерии ( E. coli) 1 4200 50 Дрожжи 500 40 3,6 Дрозофила 3500 40 2,6 Тритон 15000 200 0,5 Млекопитающие ( Mus musculum ) 25000 150 2,2 http://www.rumvi.com/products/ebook
В процессе репликации ДНК выделяют фазы: – инициации (начало), – элонгации (удлинение), – терминации (завершение) Репликация ДНК 24 http://distant-lessons.ru/lekcii-po-biologii/ximicheskij-sostav-kletki/nukleinovye-kisloty/dnk
Схема инициации репликации у эукариот Инициация репликации ДНК эукариот начинается с образования комплекса ориджина репликации и белка-инициатора репликации. Этот комплекс называется пострепликативным (роst.-RС). Он служит платформой для сборки структур более высокого порядка, которые переводят хроматин в состояние, компетентное для репликации. Последовательные стадии образования комплексов инициации репликации показаны на рисунке 25 http://www.rumvi.com/products/ebook
Биологический смысл репликации ДНК : копирование генетической информации для переноса ее следующему поколению : * двойная спираль раскручивается; * каждая родительская цепь служит в качестве матрицы для синтеза новой дочерней цепи; * в ходе синтеза дочерних цепей возникают новые комплементарные пары; * в результате репликации образуются две новые одинаковые дочерние цепи. 26
27 Родительская ДНК Репликационный глазок Дочерние молекулы ДНК Репликативные вилки
Область начала репликации хромосомы, оriС ( origin of chromosome ), включает в себя участки со специфическими последовательностями, так называемыми ДНК-боксами, и расположенными между ними короткими последовательностями. ДНК-боксы со специфическим «мотивом» нуклеотидов, преимущественно в 9 пар нуклеотидов, перемежаются фрагментами в 12-1З пар нуклеотидов с высоким содержанием АТ. Схема минимального ориджина прокариот. Схема ориджина вируса SV40. Схема ориджина Shizosaccharomyces pombe (дрожжи) 28 http://www.rumvi.com/products/ebook
В каждой точке ‘ origin ’ образуется «глазок» репликации. Общие свойства ориджинов репликации: 1. Точки начала репликации – это уникальные сегменты ДНК, содержащие множественные короткие повторы; 2. Эти повторы узнаются мультимерными ориджин-связывающими белками, которые играют ключевую роль в сборке ферментативных комплексов в участках начала репликации; 3. Области ориджина содержат АТ-богатые участки ( аденин-тимин богатые участки), облегчающие расплетание ДНК. 29 ДНК-полимераза III Родительская ДНК Репликационный глаз праймаза http://do.gendocs.ru/docs/index-16106.html
30 В ходе репликации достраивается 3ʹ- конец цепи ДНК
31 ведущая (лидирующая) цепь ДНК РНК-затравка Фрагменты Оказаки Запаздывающая цепь РНК-затравки Схема прерывистой репликации на запаздывающей цепи была доказана Рейджи Оказаки в 1968 г. Он провел эксперимент на бактериях E.coli, зараженных бактериофагом Т4.
Синтез запаздывающей цепи осуществляется с помощью отдельных фрагментов, которые называются фрагментами Оказаки. Фрагменты Оказаки у бактерий имеют длину 1 000 – 2 000 нуклеотидов. У эукариотических организмов в 10 раз меньше – 100 – 200 нуклеотидов. Каждый фрагмент Оказаки состоит из небольшого участка РНК (10-12 нуклеотидов), который называется РНК-праймером или РНК-затравкой, и участка ДНК. При дальнейшем «созревании» запаздывающей цепи РНК-праймеры удаляются и замещаются участком ДНК. Фрагменты Оказаки между собой сшивает ДНК-лигаза. 32
33 dna.microbiologyguide.com ДНК-полимераза ДНК-лигаза ДНК-праймаза РНК-праймер Фрагменты Оказаки ДНК-полимераза Геликаза Топоизомераза Лидирующая цепь Запаздывающая цепь Одиночная цепь со связанными белками
34 http://www.pdbj.org/eprots/index_en.cgi?PDB%3A3BEP Лидирующая цепь Запаздывающая цепь ДНК-полимераза Топоизомераза Родительская цепь ДНК-праймаза РНК-праймер ДНК-геликаза Стабилизирующие белки (SSB белки)
В репликации молекулы ДНК принимают участие ферменты: • ДНК-топоизомеразы - ферменты изменяющие степень сверхспирализации ДНК • ДНК-хеликаза ( геликаза ) - фермент разделяющий цепи двухцепочечной ДНК на одинарные цепи. • ДНК-праймаза - это фермент РНК-полимераза, синтезирующий короткий фрагмент РНК, называемый праймером, комплементарный одноцепочечной матрице ДНК. • ДНК-полимеразы - ферменты катализирующие синтез дочерних цепей на матрице ДНК по принципу комплементарности. • ДНК-лигаза - фермент катализирующий сшивание одноцепочечных фрагментов ДНК. 35
ДНК-топоизомеразы, находясь перед репликативной вилкой, разрезают молекулу ДНК для облегчения ее расплетания и раскручивания молекулы ДНК, после чего непрерывность ее восстанавливается. ДНК-топоизомеразы действуют путем создания временного однонитевого или двунитевого разрыва в молекуле ДНК, проведения сквозь разрыв другого, целого сегмента цепи и воссоединения цепи в месте разрыва. В результате такого ферментативного акта целостность цепей сохраняется, но их топологическое состояние может измениться. Топоизомеразы убирают суперспирализацию ДНК 36 Схема строения человеческий топоизомеразы I в комплексе с ДНК. http://www.nanonewsnet.ru/news/2012/chtoby-vylechit-geneticheskoe-zabolevanie-nuzhno-razbudit-ottsovskii-gen
Разделение закрученных в биспираль полинуклеотидных цепей ДНК осуществляется ферментом геликазой при участии дестабилизирующего белка. Структура геликазы RuvA Хеликазы – это ферменты, способные расплетать две комплементарные нити в ДНК с использованием энергии, полученной при гидролизе АТФ. Продвижение хеликаз идет в направлении вместе с репликативной вилкой. 37 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/697729 http://kodomo.cmm.msu.ru/~anuta_al/SCOP.html
ДНК-праймаза ( РНК-полимераза ) необходима для инициации репликации Праймаза – фермент, синтезирующий РНК-праймеры для запуска синтеза ведущей цепи ДНК и запуска синтеза фрагментов Оказаки на запаздывающей цепи ДНК. Праймаза активируется ДНК-хеликазой и находится с ней в комплексе, который называется праймасомой. Без РНК-праймеров синтез ДНК начаться не может. 38 РНК-праймер ДНК-матрица ДНК-праймаза ( РНК-полимераза ) Primase 3B39 http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d5/Primase_3B39.png
Ферментом, катализирующим образование дочерних полинуклеотидных цепей, является ДНК-полимераза, представляющая собой сложный мультимакромолекулярный комплекс. 39 http://www.biochem.umd.edu/biochem/kahn/bchm465-01/prokdnarep/dnap3.html http://www.strf.ru/photo.aspx?d_no=15831
Общие свойства ДНК-полимераз : 1. для работы нуждаются в однонитевой матрице (не способны расплетать двойную нить); 2. могут только удлинять предсуществующую нить ДНК, но не способны инициировать синтез – так называемая потребность в затравке ( праймере ); Однонаправленность ( униполярность ) синтеза: синтез каждой дочерней цепи ДНК происходит всегда в направлении 5' 3'. 40 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/885896 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_polymerase.png?uselang=ru
В 1961 г. М. Мезельсон и Ф. Вейгл на примере фага показали, что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоединение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента, участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 году такой фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты. ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репликации и репарации ДНК. 41 http://dnaligase.blogspot.ru/ http://www.biochem.umd.edu/biochem/kahn/molmachines/replication/DNA%20Ligase.htm http://www.biotechnolog.ru/ge/ge2_5.htm
Источники повреждения ДНК: УФ излучение радиация химические вещества ошибки репликации ДНК апуринизация дезаминирование и др. – УФ излучение – радиация – химические вещества – ошибки репликации ДНК – апуринизация – дезаминирование 42 http://www.fmbcfmba.org/default.asp?id=60061
РЕПАРАЦИЯ ( от лат. reparatio — восстановление ), свойственный клеткам всех организмов процесс восстановления природной ( нативной ) структуры ДНК, повреждённой при нормальном биосинтезе ДНК в клетке, а также физическими или химическими агентами. 1. Вся информация о механизмах репарационных процессов, закодирована в ДНК. 2. Репарация осуществляется специальными ферментными системами клетки. 3. В основе процессов репарации лежит принцип спаривания комплементарных оснований ДНК. 43 http://archive.sciencewatch.com/dr/fmf/2011/11mayfmf/11mayfmfSimm/
44 Инструмент репарации ДНК, *белок-перстень* Rad52. Изображение: NCBI Инструмент репарации ДНК Flp. Изображение: NCBI Инструмент репарации ДНК Integrase. Изображение: NCBI http://www.epochtimes.ru/content/view/6898/5/
45 ДНК Повреждение Воздействие Алкилирование Химические агенты (мутагены) Пиримидиновый димер УФ-излучение Аддукт Радиация, химические агенты Однонитевой разрыв Радиация, химические агенты Двунитевой разрыв Ионизирующая радиация Межнитевая сшивка Химические агенты 8-оксигуанин Токсичные радикалы Апуриновая ( апиримидиновая ) брешь Спонтанные ( t°, pH ), химические агенты
46 Тиминовый димер 6-4-фотопродукт
Фермент Свойства Эндонуклеазы Гидролизуют фосфодиэфирную связь внутри одной из цепей ДНК, образуя однонитевой разрыв Экзонуклеазы Удаляют нуклеотиды по одному с 3’- или 5’- конца полинуклеотидной цепи ДНК-полимеразы Заполняют бреши, образованные экзонуклеазами ДНК-лигаза Восстанавливает разорванную фосфодиэфирную связь ДНК-хеликазы Расплетают цепи ДНК ДНК-гликозилазы Удаляют поврежденное основание с образованием АП-сайта 47
48 Репарация ДНК Дорепликативная Пострепликативная сопровождает репликацию ДНК затрагивает уже образованные биспирали ДНК Световая Темновая фотореакти-вация Прямая Непрямая
Фотореактивация служит мощным инструментом исследования летальных и мутационных повреждений, так как их репарация под влиянием света может быть использована в качестве критерия для решения вопроса о том, обусловлена ли инактивация ДНК образованием пиримидиновых димеров 49 Механизм фотореактивации действует только на димеры. В этом процессе участвует фермент фотореактивации, который связывается с пиримидиновыми димерами. Образующийся фермент-субстратный комплекс активируется видимым светом, что приводит к мономеризации димеров in situ. Таким образом, летальный эффект УФ-облучения существенно снижается, если облученные клетки подвергаются затем воздействию видимого света (длина волн от 360 до 420 нм). http://www.bioinformer.ru/binfs-113-1.html
Под « темновой репарацией» понимают репарацию без участия света. В настоящее время известны две системы такого типа: эксцизионная репарация и пострепликативная рекомбинационная репарация. Репарация первого типа требует присутствия ферментов, которые узнают нарушения структуры ДНК, удаляют затронутые участки, замещая их нормальными нуклеотидными последовательностями, и, наконец, восстанавливают первоначальную структуру ДНК, замыкая полинуклеотидную цепь. 50 http://www.bioinformer.ru/binfs-113-1.html
51 Схема эксцизионной репарации оснований и нуклеотидов Этапы эксцизионной репарации: 1. разрыв цепи ДНК вблизи повреждения под действием эндонуклеазы, узнающей нарушения структуры ДНК; 2. удаление пиримидиновых димеров, осуществляемое экзонуклеазой. Удаление димеров сопровождается дополнительной деградацией ДНК с образованием брешей, размеры которых варьируют от 20 до 400 нуклеотидов; 3. заполнение брешей с помощью ДНК-полимеразы, использующей в качестве матрицы комплементарную цепь ДНК; 4. восстановление целостности полинуклеотидной цепи в результате сшивания разрыва лигазой. http://www.fmbcfmba.org/default.asp?id=600322
52 Пострепликативная (рекомбинационная) репарация. Полухроматидная последовательность вырезается, репарация происходит после репликации с участием другого продукта деления. http://userdocs.ru/biolog/22420/index.html?page=35 Пострепликативная ( внутрирепликативная ) репарация - тип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей поврежденные участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе рекомбинационной или репарационной репликации.
53 Синтез ДНК (ДНК-полимераза III) «проскакивает» участок, содержащий повреждение. В результате участок дочерней цепи ДНК содержит брешь длиной до нескольких тысяч нуклеотидов. Эта брешь репарируется с помощью рекомбинации.
Многие мутагены повреждают основания ДНК, что приводит к невозможности специфического спаривания оснований. В результате репликация блокируется. У про- и эукариотических организмов репликационные блоки обходятся с помощью встраивания неспецифических оснований. У E.coli этот процесс нуждается в индукции SOS- системы. Ключевая роль в SOS- индукции принадлежит белку RecA. Он связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филаменты, представляющие собой активную форму белка, обозначаемую как RecA *. RecA * является сигналом, запускающим индукцию SOS- регулона (около 30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массовых повреждениях ДНК. В SOS- регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых необходимы для «обходной» ( translesion ) репликации. Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций. 54
55 Пигментная ксеродерма Нарушена эксцизионная репарация. Клинические проявления: дерматозы под действием солнечного света рак кожи неврологические нарушения дефекты роста и развития преждевременное старение различных систем
56 Синдром Блума Подавлен репаративный синтез. Дефект ДНК-хеликазы. Высокая частота хромосомных аберраций. Клинические проявления: задержка роста и развития нарушения иммунной системы - предрасположенность к раковым заболеваниям предрасположенность к инфекционным заболеваниям свето-индуцируемое поражение капилляров кожи
57 Общие принципы репарации Процессы репарации являются одним из основных механизмов поддержания стабильности генетического материала. Чем серьезнее повреждение, тем большее количество ресурсов клетки привлекается на исправление ошибок. Принцип «меньшее из зол»: репарация ценой жертв, например, с мутагенным эффектом. Системы репарации не функционируют со 100% эффективностью. В результате часть предмутационных повреждений реализуется в мутации. http://www.salon.com/2012/10/11/cheaper_dna_sequencing_brings_privacy_risks/
