Резяпкин Виктор Ильич доцент кафедры биохимии v.rezyapkin@grsu.by
В основе репликации лежит принцип комплементарности В результате репликации образуются дочерние молекулы НК, нуклеотидные последовательности которых идентичны между собой и с материнской молекулой НК
Полуконсервативный – вновь синтезированная молекула НК состоит из одной материнской и одной дочерней полинуклеотидных цепей НК Консервативный – вновь синтезированная молекула НК состоит только из дочерних полинуклеотидных последовательностей Дисперсный – вновь синтезированная полинуклеотидная цепь НК состоит из фрагментов дочерних и материнских полинуклеотидных последовательностей Для прокариот и эукариот характерен полуконсервативный тип репликации У вирусов встречаются все три типа репликации
ДНК-полимеразы ДНК-полимеразы осуществляет синтез ДНК. Субстратом ДНК-полимераз являются дезоксинуклеотид-5’-трифосфаты: дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ. Уравнение этой реакции в общем виде выглядит так:
ДНК-полимераза последовательно добавляет нуклеотиды к 3’ – концу полинуклеотидной цепи
Синтез новой цепи происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. ДНК-полимераза может только наращивать цепь ДНК, начать же синтез ДНК с нуля она не может, (для начала ее работы требуется затравка) В качестве затравки может выступать ДНК или РНК ДНК-полимераза способна удлинять цепь только в присутствии цепи, играющей роль матрицы Нуклеотиды присоединяются к затравке в соответствии с принципом комплементарности, напротив аденина всегда будет встроен тимин, а напротив гуанина – цитозин.
. ДНК-полимераза наращивает цепь в направлении 5’ 3’. Для этого ей нужны матрица и затравка
Задача ДНК-полимеразы – снять точную копию с матрицы ДНК-полимераза проверяет комплементарность каждого нуклеотида дважды: перед включением его в состав растущей цепи перед тем как включить следующий нуклеотид. Очередная фосфодиэфирная связь образуется, если последний нуклеотид комплементарен матрице. Если включен некомплементарный нуклеотид, то он удаляется за счет 3 5 ’ -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы
Праймаза – синтезирует праймер (РНК-затравку)
ДНК-лигаза соединяет 5 ’ -фосфатную и 3 ’ -гидроксильную группы соседних нуклеотидов, в результате образуется фосфодиэфирная связь, ликвидирующая разрыв
ДНК-хеликаза осуществляет расплетение двойной спирали ДНК, используя энергию гидролиза АТФ Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК ( SSB -белки), обладают большим сродством к одноцепочечной ДНК, препятствуют образованию двойной спирали. Топоизомеразы снимают напряжения, возникшее в результате расплетения двойной спирали в ДНК, за счет разрыва и последующего воссоединения цепи ДНК
Репликация ДНК начинается в определенном месте – в точке начала репликации Репликация от точки начала репликации может происходить в одном или двух направлениях
Бактериальная хромосома имеет одну точку начала репликации, т.е. представляет собой единицу репликации, получившее название репликон Иначе говоря, бактериальная хромосома представлена одним репликоном
ДНК эукариот представлена множеством репликонов
Организм Количество репликонов Средний размер репликона, тыс.п.н. Скорость движения репликативной вилки п.н./мин. E.coli 1 4200 50000 Дрожжи 500 40 3600 Дрозофила 3500 40 2600 Ксенопус (лягушка) 15000 200 500 Мышь 25000 150 2200 Бобы 35000 300 2200
ДНК-полимеразы E.coli ДНК-полимераза I. На одной полипептидной цепи содержится 2 активных центра: 1-ый – ответственен за полимеразную и 3’ → 5’- экзонуклеазную активности. Последняя обеспечивает удаление ошибочно встроенных нуклеотидов. 2-ый – за 5 ’ → 3 ’- экзонуклеазную активности. Эта активность необходима для удаления РНК-затравки в процессе репликации.
ДНК-полимераза I (кольцеобразная структура, состоящая из нескольких одинаковых молекул белка, показанных разными цветами)
ДНК-полимераза II. Обладает полимеразной и 3’ → 5’- экзонуклеазной активностями Лучше всего работает на двухцепочечных ДНК с брешами Основное назначение – репарация ДНК
ДНК-полимераза III. Обладает полимеразной и 3’ → 5’- экзонуклеазной активностями Основное назначение – репликация ДНК Скорость синтеза – 500 нуклеотидов в секунду
Хромосома Е. coli имеет одну точку начала репликации ( oriC ), ее - размер 258 н. п. OriC узнает белок Dna А и инициацирует репликацию. АТФ-зависимая хеликаза начинает расплетать дуплекс ДНК. Топоизомераза, располагаюсь впереди по ходу движения репликативной вилки, снимают напряжение, возникаюшее в результате расплетения двойной спирали в ДНК. С одноцепочечными участками ДНК связывается SSB -белок. Праймаза осуществляет синтез затравки. В работу включается ДНК-полимераза III. Поскольку синтез ДНК осуществляется в направлении 5’→ 3’, одна цепь синтезируется непрерывно (ведущая цепь), вторая фрагментами (отстающая цепь) по 1000 – 2000 нуклеотидов (фрагменты Оказаки).
По окончанию синтеза фрагмента Оказаки ДНК-полимераза I за счет 5’→ 3’-экзонуклеазной активности удаляет затравку и заменяет ее на ДНК. После действия этого фермента между фрагментами Оказаки остается разрыв, который сшивает ДНК-лигаза.
Терминация репликации происходит после удвоения кольцевой молекулы ДНК.
У эукариот обнаружено несколько ДНК-полимераз: ДНК-полимераза α образует прочный комплекс с праймазой. Этот комплекс способен инициировать синтез ДНК de novo. Вначале праймаза комплекса синтезирует РНК-затравки длиной около 10 нуклеотидов, затем ДНК-полимераза начинает синтез ДНК. У ДНК-полимеразы α 3'→5'-экзонуклеазная активность как правило отсутствует. ДНК-полимераза β принимает участие в процессинге фрагментов Оказаки и репарации ядерной ДНК.
ДНК-полимераза δ обладает полимеразной и 3' → 5'-экзонуклеазной активностями. ДНК-полимераза ε обладает полимеразной и 3' → 5'-экзонуклеазной активностями. ДНК-полимераза γ обеспечивает репликацию и репарацию митохондриальной ДНК, она кодируется ядерным геномом. ДНК-полимераза обладает полимеразной и 3' → 5'-экзонуклеазной активностями, осуществляет синтез ДНК при SOS -репарации. Скорость синтеза ДНК у эукариот приблизительно на порядок ниже, чем у прокариот и составляет около 50 нуклеотидов в секунду.
Размер фрагментов Оказаки у эукариот меньше, чем у прокариот и составляет около 100 нуклеотидов. Инициация репликации у эукариот происходит на многочисленных точках начала репликации. У млекопитающих точки начала репликации располагаются на расстоянии ~ 100 тыс. н. п. друг от друга. Синтез ДНК в репликонах происходит в двух направлениям. Наличие многочисленных репликонов у эукариот связано с большими размерами ДНК и более низкой активностью ДНК-полимераз.
Продвижение репликативной вилки прекращается при столкновении с другой вилкой или при достижении конца хромосомы. в результате репликации образуются две дочерни молекулы ДНК, являющееся точными копиями материнской. Причем каждая дочерняя молекула ДНК состоит из одной материнской и одной дочерней цепей ДНК. Такой тип репликации называется полуконсервативным. Образовавшиеся молекулы ДНК в результате митоза распределяются между дочерними клетками. Репликация обеспечивает воспроизведение генотипов в ряду поколений.
Репликация генома аденовирусов (терминальная инициация с использованием нуклеотид-белковой затравки)
Роль затравки выполняет комплекс терминального белка и одного нуклеотида
Схема репликации SV-40
Схема репликации λ -фага (репликация по схеме вторично разматывающегося кольца) В клетке линейная ДНК λ -фага за счет липких концов образует кольцо и превращается в ковалентно-непрерывную форму
Схема репликации генома по схеме катящегося кольца ( φ X174)
Схема репликации парвовирусов (терминальная инициация при помощи само-затравочного механизма. Оба конца цепи ДНК способны образовывать шпильки
Схема репликации генома вируса гриппа Геном вируса гриппа представлен 8 молекулами одноцепочечных –РНК от 900 до 2350 нуклеотидов
Схема репликации генома реовирусов Содержат 10 сегментов двухцепочечных РНК, РНК-полимеразу, способную использовать дуплекс для синтеза +РНК На первых этапах +РНК используется в качестве матрицы для синтеза белка, затем +РНК служет матрицей для синтеза двухцепочечных РНК
ВИЧ
Апуринизация Ежедневно клетка человека теряет около 5000 пуринов. Результатом апуринизации является АР-сайт – дезоксирибоза лишенная основания
Дезаминирование Дезаминирование цитозина после репликации приводит к мутации, т.к. образовавшийся урацил комплементарен аденину, а не гуанину
Алкилировани е Алкилированные азотистые основания могут образовывать некононические пары, например, 7-этилгуанин с тимином, способствовать апуринизации.
Образование пиримидиновых (тиминовых) димеров (под действием ультрафиолетового света) Размыкание пуринового кольца Одноцепочечные и двухцепочечные разрывы ДНК Межцепочечные сшивки
Фотореактивация Фотолиаза, активированная светом, распознает пиримидиновыми димеры в ДНК, присоединяется к ним и разрывает возникшие между пиримидиновыми кольцами связи. После этого фотолиаза отходит от ДНК. Восстановление структуры ДНК на этом завершено.
Метилтрансферазы удаляют метильные группы с модифицированных оснований и благодаря этому восстанавливают исходную структуру ДНК. Метилтрансфераза, захватив метильную группу, не может от нее освободиться.
ДНК-лигаза соединяет разорванные цепи в молекуле ДНК
Ковалентная связь между пуриновым основанием и сахаром может рваться. В молекуле ДНК образуется брешь, названная АР-сайтом. Инсертазами (от англ. insert - вставлять) могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до поражения, и соединять его с сахаром. Структура ДНК приобретает исходный неповрежденный вид.
Поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин "эксцизионная репарация", от англ. excision - вырезание) Образовавшиеся бреши заполняются неповрежденным материалом Существуют два варианта эксцизионной репарации
Гликозилазы узнают разнообразные поврежденные основания и рвут гликозидные связи между модифицированным основанием и дезоксирибозой, в результате образуются АР-сайты. АР-сайт распознается АР-эндонуклеазой. Она вносит разрыв в цепи молекулы ДНК Далее в работу вступает фосфодиэстераза: она отщепляет от ДНК сахарофосфатную группу, к которой теперь не присоединено основание. Появляется брешь в цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бреши в противоположной нити ДНК расположен неповрежденный нуклеотид ДНК полимераза вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид. ДНК-лигаза соединяет разрыв нити ДНК Повреждение восстановлено
Процесс можно разделить на четыре этапа: а) распознавание поврежденного участка ДНК; б) двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия); в) заполнение бреши в процессе репаративного синтеза; г) лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК.
Во время репликации ДНК происходят ошибки спаривания. Неправильное спаривание может затронуть только дочернюю нить ДНК; матричная нить в процессе репликации остается неизменной. Следовательно, система репарации должна проводить замену некомплементарных оснований только на дочерней цепи. Клетки используют различие в структуре матричной и дочерней нитей. Материнская нить ДНК несет метилированные аденины, а в дочерней нити до окончания репликации аденины еще не метилированы. Пока они остаются неметилированными, клетки исправляют ошибки.
Чтобы залечить имеющую повреждение ДНК во время репликации, клетка прибегает к следующему приему.
SOS-репарация используется, когда повреждений в ДНК становиться много. Степень индукции SOS- репарации пропорциональна количеству повреждений в ДНК. При небольшом числе повреждений увеличивается число репаративных белков. При большем числе повреждений приостанавливается деление клетки и индуцируется синтез еще большего числа репаративных белков.
При еще большем числе повреждений в клетке синтезируются белки, которые способствуют ДНК-полимеразе осуществлять синтез дочерней цепи ДНК, используя в качестве матрицы дефектные звенья материнской цепи. В связи с этим в дочерней цепи ДНК появляется много ошибок. Благодаря SOS-репарации происходит удвоение ДНК и клетка может разделиться. Дочерние клетки выживут, если жизненно важные функции, закодированные в ДНК, сохраняться, если же нет – погибнут.
Пигментная ксеродермия. У носителей болезни под действием обычного солнечного света, в котором всегда присутствуют УФ-лучи, на коже возникают сначала красные пятна, которые постепенно переходят в незарастающую коросту, чаще всего трансформирующуюся в раковые опухоли Первопричиной этого заболевания служат дефекты разных репарирующих систем. В настоящее время известно, что многие другие наследственные болезни человека обязаны своим возникновением повреждениям отдельных этапов различных процессов репарации.
