1. По характеру взятого материала различают следующие виды гистологических препаратов: а) срезы органов (толщиной 5-15 нм), б) мазки (крови, костного мозга и т.д.) и отпечатки (напр., селезёнки), в) плёнки (брюшины, мягкой мозговой оболочки), или тотальные препараты Чаще всего используются срезы. 2. Приготовление препарата обычно включает 5 следующих этапов: а) взятие и фиксация материала, б) обезвоживание и уплотнение материала, в) приготовление срезов, г) окрашивание препаратов и д) заключение в консервирующую среду.
осуществляется для “закрепления” его прижизненного строения. Она предотвращает разложение извлеченных из организма тканей под действием собственных ферментов и способствует сохранению целостности клеточных и тканевых структур. Воздействуя на ткани, фиксатор (например, формалин, спирт, пикриновая кислота или различные сложные смеси веществ), вызывает необратимую коагуляцию белков и быструю гибель клеток.
осуществляется путем последовательного помещения кусочка такни в спирты возрастающих концентраций для удаления из него воды. Оно необходимо для выполнения следующего этапа обработки материала - его заливки
достигается путем пропитывания обезвоженного кусочка затвердевающими средами: расплавленным парафином, целлоидином или специальной пластической массой. В результате заливки после охлаждения парафина или полимеризации пластмассы кусочек ткани (блок) становится достаточно плотным для получения тонких срезов при резке.
осуществляется на специальном приборе (микротоме) с помощью особых стальных ножей - бритв. При этом обычно получают срезы залитого в парафин или другую среду материала толщиной 5-7 мкм (в оптимальном варианте - серийные, т.е. следующие один за другим в виде непрерывной ленты).
1 – нож; 2 – парафиновый блок с заключенным в него образцом; 3 – срез; 4 – подающее устройство
При резке больших блоков и твердого материала срезы часто закручиваются. Однако этого можно избежать путем придерживания и приподнимания среза кисточкой за передний его край в процессе резки.
Для получения срезов нефиксированной ткани, а также в случаях, когда необходимо изучить объект в короткий промежуток времени, используют замораживающие микротомы, снабженные замораживающим столиком, на котором укрепляется исследуемый объект. Столик гибким шлангом соединен с металлическим баллоном, в котором находится жидкая углекислота. Для замораживания тканевых блоков применяют также термоэлектрический охлаждающий столик (ТОС-1)
Ксилол 1 10-15 мин., можно в термостате при 37 С Ксилол 2 3-5 мин Спирт 100%-1 1-2 мин Спирт 100%-2 ополоснуть Спирт 96%-1 ополоснуть Спирт 96%-2 ополоснуть Дистиллированная вода 2 смены
обычно производится после их приклеивания на предметное стекло и удаления из них парафина (депарафинирования). Окрашивание позволяет выявить различные структурные компоненты тканей и клеток благодаря их неодинаковому сродству к гистологическим красителям.
Тип красителя Пример Окрашиваемые структуры Индиффрентные красители Судан III, судан IV Суданом окрашиваются жировые капли (в которых он растворяется). Кислые красители Кислоты и кислые соли : эозин (искусственная краска; название - от греч. эос - заря); кислый фуксин. а) Окрашиваемые структуры называются оксифильными (имеющими сродство к кислым красителям). б) Это белковые компоненты цитоплазмы и неклеточные структуры (коллагеновые волокна).
Основные красители Основные соли : гематоксилин (точнее, продукт его окисления - гематеин); азур 2, кармин. а) Красящиеся структуры – базофильные (сродство к основным красителям). б) Это структуры, богатые нуклеиновыми или иными кислотами – ядра,рибосомы,аморфный компонент межклеточного вещества Нейтральные красители Смесь двух красителей: основного ( азур 2 ) и кислого ( эозин ). а) Структуры, воспринимающие кислые красители, окрасятся эозином; пример - специфические гранулы в эозинофильных лейкоцитах. б) Ядра всех клеток окрашиваются азуром 2.
1.а) Самый распространённый метод окраски. б) Сочетает основной и кислый красители. в) Поэтому позволяет выявить почти все клетки и многие неклеточные структуры. 2. При этом ядра прокрашиваются гематоксилином, т.е. приобретают сине-фиолетовый цвет, а цитоплазма красится эозином в желтовато-розовый цвет. 3. Замечание: используемый гематоксилин готовится по методу Эрлиха: окисляется до гематеина калийными квасцами.
а) На снимке видны кишечные ворсинки (1): они находятся на внутренней поверхности тонкой кишки. б) Ворсинки покрыты одним слоем эпителиальных клеток. в) Ядра (2) этих клеток – фиолетового, а цитоплазма (3) – розового цвета.
1. Применяется для окраски мазков крови и красного костного мозга. Здесь тоже используются 2 красителя: основной – азур II, окрашивающий базофильные структуры в тёмно-синий цвет, и кислый – эозин, красящий оксифильные структуры в ярко-розовый цвет. 2. Отличия от приготовления срезов таковы: фиксацию мазков проводят чистым метанолом ; окрашивание продолжают всего 30-45 мин, а не несколько часов; для заключения под покровное стекло используют кедровое масло, а не канадский бальзам. 3. В результате эритроциты приобретают розовый цвет, цитоплазма большинства лейкоцитов – голубой или синий цвет, цитоплазматические гранулы окрашиваются в зависимости от их природы.
Среди многочисленных эритроцитов видны: лейкоцит (1) с очень мелкой нейтрофильной (фиолетово-розовой) зернистостью в цитоплазме, а также гораздо более мелкие тромбоциты.
1. Препарат предварительно обрабатывают (протравляют) железноаммиачными квасцами, а потом обрабатывают гематоксилином. 2. Структуры приобретают коричневато-серый цвет. 3. Хорошо выявляются структуры ядра, границы клеток, мышечные волокна. Препарат - срез языка. В мышечных волокнах видны ядра (1) и отчётливая поперечная исчерченность.
1. Краситель – смесь кислого фуксина, анилинового синего и оранжевого G. 2. Коллагеновые волокна окрашиваются в синий цвет. Препарат - срез мышцы. Мышечные волокна (1) – розовые, а прослойки соединительной ткани (2 и 3) между ними – синие.
1. На снимке - женская половая клетка (ооцит), находящаяся в фолликуле яичника. Цитоплазма (1) клетки окрашена в слабо-розовый, окружающая её блестящая оболочка (2) - в сине-голубой, а ядра фолликулярных клеток (3) - в фиолетовый цвет. 2. Синий цвет блестящей оболочки свидетельствует о том, что в ней, помимо прочих компонентов, содержатся коллагеновые волокна. Окраска по Маллори используется не только для выявления компонентов соединительной ткани, но и в иных целях, например, для дифференциации эндокринных клеток гипофиза.
Красители – пикриновая кислота и кислый фуксин: коллагеновые волокна окрашиваются в ярко-красный цвет, а элементы других тканей (напр., мышечные волокна ) – в жёлтый цвет.
1. Препарат обрабатывают аммиачным раствором серебра, а затем – восстановителями. 2. Выделяющееся серебро осаждается на ретикулярных (аргирофильных) волокнах (богатых SH-группами), и волокна приобретают чёрный цвет. Препарат - срез лимфоузла. Видны многочисленные ретикулярные волокна (1), образующие густую сеть.
эластические волокна и мембраны (если таковые имеются) приобретают вишнёвый цвет; остальные структуры – слабо-розовый. Препарат - срез аорты. В её средней оболочке (II) обнаруживаются многочисленные эластические мембраны (1) – в виде толстых извилистых линий, расположенных концентрически.
эластические волокна окрашиваются в жёлтый цвет, коллагеновые волокна – в красный цвет, ядра клеток – в фиолетовый цвет. Препарат – срез эластической связки. Видны пучки эластических волокон (1) и между ними – клетки (фиброциты) (2).
1. Вначале кусочек кости для размягчения подвергают декальцинации (с помощью кислоты). 2. Краситель – раствор тионина. 3. Стенки костных полостей и канальцев (выстланные сетью коллагеновых волокон) окрашиваются в тёмно-коричневый цвет; остальной фон – светло-коричневый. Препарат - срез трубчатой кости. В костном веществе видны костные полости (1), содержащие тела костных клеток (остеоцитов), и костные канальцы (2), содержащие отростки остеоцитов.
1. В этом методе фиксацию материала в формалине проводят не менее 7 дней, а уплотнение образца осуществляют путём замораживания. 2. При окрашивании срез обрабатывают растворами азотнокислого серебра, формалина, аммиачного серебра. 3. Клетки и волокна нервной системы окрашиваются в чёрный цвет, а окружающие ткани – в светло-коричневый цвет.
Видны нервные клетки, имеющие тёмную цитоплазму, более светлое ядро (1) и отростки (2 и 3 ).
1. Красителем служит толуидиновый синий, окрашивающий умеренно базофильные соединения в синий цвет. 2. Таким образом в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются глыбки базофильного вещества (т.н. субстанция Ниссля ). Препарат - срез спинного мозга. Вышеуказанные глыбки содержатся в теле (1) нейрона и в некоторых отростках (2).
1. Метод применим для выявления всех структур, богатых липидами или жирами, – мембран, жировых или липидных капель и т.д. 2. Растворяя в себе осмиевую кислоту, эти структуры приобретают чёрный цвет.
Видны поперечные срезы миелиновых нервных волокон. У каждого из них светлый осевой цилиндр (1) окружён толстой миелиновой оболочкой (2). Последняя имеет мембранную природу и потому – осмиофильна.
Гистохимические методы основаны на специфической реакции между химическим реактивом и определённым компонентом препарата. Образующийся продукт реакции имеет окраску, отличную от окраски исходного реактива
1. Реактив – смесь двух красителей: метилового зелёного и пиронина. 2. Пиронин окрашивает структуры, богатые РНК, в малиновый цвет. Другие структуры – зелёные. 3. Чтобы проверить специфичность окраски, делают контрольный препарат, который перед окрашиванием обрабатывают рибонуклеазой. Препарат - срез поджелудочной железы. В малиновый цвет окрашены цитоплазма (1) и ядрышки (2) секреторных клеток – из-за высокого содержания в них РНК (в составе рибосом и их предшественников).
1. Основной реактив – фуксинсернистая кислота (реактив Шиффа). 2. а) Под его действием ДНК-содержащие структуры окрашиваются в вишнёвый цвет. б) Прочие структуры – зелёные. Препарат - срез печени. Распределение окраски – противоположное предыдущему: в вишнёвый цвет красится хроматин (1) в ядрах, а ядрышки (2) и цитоплазма (3) клеток оказываются зелёными.
Используются различные реакции; в том числе: с бромфеноловым синим (у белков - тёмно-фиолетовая окраска); со смесью нингидрин-реактив Шиффа ( белки приобретают красный цвет).
1. Реактив - Шифф-периодная кислота (выделенные буквы и составляют аббревиатуру ШИК). 2. Периодат способствует образованию в субстрате альдегидной группы, которая взаимодействует с реактивом Шиффа. 3. На препарате ШИК-положительные компоненты (например, гранулы гликогена) имеют фиолетовый или тёмно-красный цвет.
На снимке – кишечная ворсинка. В составе покрывающего её эпителия выделяются своей фиолетовой цитоплазмой т.н. бокаловидные клетки (1). Эти клетки активно секретируют слизь, отчего в их цитоплазме накапливаются полисахариды – компоненты слизи.
1. При взаимодействии толуидинового синего с веществами, содержащими много кислотных групп, наблюдается метахромазия – изменение окраски с синей на фиолетовую и красную. 2. Подобным свойством обладают, в частности, компоненты межклеточного аморфного вещества соединительной ткани – гликозамингликаны (являющиеся гетерополисахаридами с высоким содержанием кислотных радикалов).
Снимок показывает, что стенка аорты богата гликозаминогликанами.
1. Как уже отмечалось, судан III – представитель индифферентных, или липофильных, красителей. 2. Проникая в клетки, он растворяется в жировых и липидных каплях и тем самым окрашивает их в ярко-оранжевый цвет.
Препарат является тотальным, т.е. перед нами - не срез органа, а участок сальника, растянутый на предметном стекле. Видны жировые клетки ; каждая из них содержит крупную каплю жира (1), которая занимает почти всю цитоплазму и окрашена в ярко-оранжевый цвет. Клеточные ядра (2) должны краситься гематоксилином в фиолетовый цвет. В данном случае они окрашены весьма слабо. Ядро оттесняется жировой каплей к периферии клетки.
