Лекция 12 Тема: Распространенные методы окраски цитологических препаратов.
Наиболее распространенными и чаще применяемыми являются красители, используемые для гематологических исследований. Это краски Романовского- Гимза, Лейшмана, Май- Грюнвальд. Качество окраски клеточных элементов зависит от: вида и состава красителя; его концентрации; продолжительности окраски; возраста окрашиваемого препарата ( препараты от 6 ч до неск. дней давности теряют мелкие структурные особенности); pH среды (6.8 – 7.2).
ОКРАСКА ПО РОМАНОВСКОМУ-ГИМЗЕ Сухие мазки фиксируют в метиловом спирте (5 мин) или в смеси Никифорова (15 мин); Погружают в рабочий раствор (1:4) готовой краски Р омановского- Гимза на 5-7 мин; Промывают дистиллированной водой, высушивают, исследуют при иммерсии. Результат : Бактерии вследствие окрашивания приобретают фиолетово-красный оттенок, цитоплазма клеток — голубой цвет, ядра — красный. Вследствие окраски простейших их цитоплазма становится голубого цвета, а ядра — красно-фиолетового.
Кровь человека (мазок) Окраска: по Романовскому-Гимзе 1 - эритроциты; 2 - нейтрофильные лейкоциты; 3 - базофильный лейкоцит; 4 - эозинофильный лейкоцит; 5 - лимфоцит; 6 – моноцит.
ОКРАСКА МАЗКОВ ПО ЛЕЙШМАНУ Приготовление краски Лейшмана : 2,5 г сухого красителя на 1 л метилового спирта. Созревает 3-4 дня. Готовый раствор фильтруют. Методика окраски: в ысушенные мазок опускают в краску Лейшмана на 3 мин.; п ромывают водой; з аливают красителем, состоящим из 40 мл азура, 30 мл эозина, 70 мл дистил.воды ( краску готовят перед работой !). Окрашивают мазки 30-40 мин.; п ромывают водой и высушивают.
ОКРАСКА МАЗКОВ ПО ПАППЕНГЕЙМУ Красители: Фиксатор Май- Грюнвальда : 250 мг порошка + 100 мл метилового спирта. Раствор греют (70°) на водяной бане, фильтруют и хранят в бутылке. Рабочий р-р готовой краски Романовского- Гимза (1 мл краски+4 мл дистил.воды ). Ход окрашивания: На мазок наливают краску-фиксатор Май- Грюнвальда на 3 мин.; Не сливая краски добавляют тоже количество дистил.воды ; Через 1 мин краску сливают и сразу добавляют краску Романовского- гимза на 5-15 мин.; Промывают дистил.водой и высушивают.
Пунктат молочной железы. Фиброзно-кистозная болезнь Структуры из клеток при доброкачественных состояниях. Структура в виде вытянутой трубочки, состоящей из двух рядов клеток, с эксцентрическим расположением ядер и просветом в центре (1). «Голое» ядро разрушенной клетки (2). Окрашивание по Паппенгейму
Окраска гематоксилин-эозином Сочетает в себе основной и кислый красители ( ядра приобретают сине - фиолетовый цвет, цитоплазма – желтовато-розовый ).
ВИДЫ ГЕМАТОКСИЛИНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для приготовления краски, гематоксилин подвергают окислению. В результате он превращается в красящее вещество – гематеин (сине-фиолетовый краситель).
Кислый гематоксилин Эрлиха 2 г гематоксилина + 100 мл 96° спирта + 100 мл дистил.воды + 100 мл глицерина + 3 г калийных квасцов + 10 мл ледяной уксусной кислоты. Краситель «созревает» 14 дней. Продолжительность окрашивания 4-6 мин. Кислый гематоксилин Майера Состав: гематоксилин алюмокалиевые квасцы йодноватокистый калий стабилизаторы консервант дистиллированная вода Продолжительность окрашивания 5-10 мин.
Кислый гематоксилин Карацци 400 мл воды + 100 мл глицерина + 0,5 г гематоксилина + 25 г алюмокалиевых квасцов + 0,03 г К J О 3. Созревание 1 нед. Продолжительность окраски препаратов 1-2 часа. Приготовление эозина 0,1 г эозина растворяют в 100 мл дистиллированной воды
Методика окраски гематоксилин-эозином : в ысушенные мазки фиксируют в смеси Никифорова (10-15 мин); окрашивают раствором гематоксилина (7-10 мин); промывают в проточной воде 1-2 мин; о крашивают 1 % водным раствором эозина (1 мин ); промывают в проточной воде 1-2 мин и высушивают.
Эмпирический метод выбора продолжительности окраски мазка гематоксилином: Ядра окрашены в светло-фиолетовый цвет без четкого различия структур – препарат недокрашен. Необходимо увеличить время окраски. Ядра темно-фиолетовые, цитоплазма тоже окрашена – препарат перекрашен. П осле промывания в дистил. воде на неск. секунд помещают в 70 % спирт и под контролем микроскопа следят за ослаблением окраски. Ядра красно-фиолетовые с четко выраженным ядрышком и хроматином, цитоплазма практически не окрашена – окраска нормальная.
Микрофотография исходного (фиксированного и высушенного) препарата. Окраска гематоксилином. Цвет окраски ядер близок к фиолетовому; цитоплазма – слабо окрашена в голубой цвет; фон препарата приобретает серовато-голубой цвет.
Эмпирический метод выбора продолжительности окраски мазка эозином : Цитоплазма едва розовая – препарат недокрашен. Д ля усиления красящих свойств эозина его подкисляют уксусной кислотой (1 капля 3% уксусной кислоты на 100 мл эозина); Фон красного цвета, микроструктуры видны нечетко – препарат перекрашен. Л ишняя окраска удаляется промыванием. Фон умеренно розовато-желтого цвета – окраска удачная.
Микропрепарат мокроты. Эластические волокна в виде тонких розовых нитей; окраска эозином.
ОКРАСКА ПО ПАПАНИКОЛАУ является мировым стандартом в скрининге рака шейки матки, используется для выявления предраковых заболеваний.
Мазок из шейки матки. Норма. Мазок из шейки матки. Рак. Клетки плоского эпителия среднего и мелкого размера; ядра разные по размерам, неправильной формы; хроматин распределен неравномерно. Окрашивание по Папаниколау.
МЕТОД ЖИДКОСТНОЙ ЦИТОЛОГИИ Для жидкостной цитологии на анализ берут соскоб с шейки матки и цервикального канала. Полученный материал врач помещает в специальный контейнер, заполненный стабилизирующей жидкостью-консервантом. Именно поэтому метод и называется жидкостной цитологией. Контейнер с биологическим материалом помещают в специальный аппарат, где в автоматическом режиме происходит выделение клеток в образец и помещение его на предметное стекло с последующим окрашиванием по Папаниколау.
