Тақырыбы:Рекомбинатты инсулин алу ҚАЗАҚСТАН РЕСПУБЛИКАСЫНЫҢ БІЛІМ ЖӘНЕ ҒЫЛЫМ МИНИСТІРІЛІГІ. Е.А.Бөкетов атындағы Қарағанды мемлекеттік университеті Биология –география факультеті ПРЕЗЕНТАЦИЯ Топ:БТ - 3 1 Қабылдаған:Кишкенебаева Д.О Орындаған студент:Ильяшова Д.Е Бекенова А.Н
Ж оспар : Кіріспе Негізгі бөлім 2.1. Ұйқы безде инсулин синтезі. 2.2.Инсулиннің жұмысы,жұмысының бұзылуы 2.3.Рекомбинатты ДНҚ 2.4.Рекомбинатты инсулинді алу Қорытынды
1869 жылы Б ерлинде 22 жасар медик студенті П. Лангерганс микроскоппен ұйқы безі құрылысын зерттеуде бұрын соң белгілі болмаған топтар құрып орналасқан клеткаларды көреді, олар бүкіл бездің бойында бір келкі таралған. 1901 жылы ұйқы безінде осындай « аралықтар » зақымдануынан қант диабеті дамуы жүретіні айтылды Кейін оларды « Лангерганс аралықтары » деп атаған.
Ф. Сенгер алғаш рет инсулиннің біріншілікті құрылысын немесе молекуласында амин қышқылдардың нақты жүйелі қатарын ұсынған. Кейін Д. Ходжкин рентгендік дифракция әдісі көмегімен инсулиннің кеңістіктегі молекула құрылымын тапты Электрогаммалы ұйқы безіндегі гранулалардағы инсулин бейнесі
Лангерганс клеткаларынан процессинг нәтижесінен препроинсулиннен проинсулин және кейін инсулин пайда болады Ұйқы безде инсулин синтезі келесі жолмен өтеді. Лангерганс клеткаларының рибосома ЭПР преинсулин деген бастауыш пептиді синтезделінеді. Ол 110 амин қышқылды қалдықтардан құралған полипептидті тізбегі және бір ізділікпен орналасқан : Сп -пептид, А-пептид, C- пептид және В-пептид. ЭПР синтезінен кейін бірден осы молекуладан сигнальды ( Сп ) пептиді – 24 амин қышқылды қатары ажыратылады ЭПР гидрофобты липидті мембранадан синтезделген молекула өтуіне қажет. Гольджи комплексіне тасымалданатын проинсулин пайда болады, онда жартылай протеолиз жүреді – проинсулин молекуласынан А және В тізбегін қосатын 31 амин қышқылды фрагменті – С- пептидін арнайы эндопептидаза көмегімен кесіліп алынады. Секреторлы гранулаларда инсулин цинк иондарымен қосылып кристалды гексамерлі агрегат түзеді. 51 амин қышқылды қалдықтары бар осындай нәруыз дисульфидті көпірмен байланысқан екі А және В полипептидті тізбектерден құралған
Инсулин процессингінің сатылары а ) - препроинсулин, Сп А С В Онда Сп – бұл сигналды пептид, нәруыздың экспрессиясына қажет, С – дәнекерлік пептид, дисульфидті байланыстар біріккенде А және В тізбектердің қажетті ориентациясын қамтамасыз етеді, А – 21 аминқышқылды қалдықтардан құралған тізбек, В – 30 аминқышқылды қалдықтан тұратын тізбек ; жалғасы
б ) - проинсулин Сп жоқ ; А С В в )инсулин А s s s s B Сп және С жоқ. жалғасы
Инсулинді ұйқы безінің Лангерганс клеткалары синтездейді, гормон организмде көмірсу алмасуын реттейді, клеткалар глюкозаны сіңіруін қамтамасыз етеді.
Инсулиннің жұмысы қалай жүреді? Инсулин глюкозаға жол ашатың кілт Канал ашылып глюкоза жасушаға кіре алады Жабық канал Инсулин рецепторы
Ұйқы безінде инсулиннің түзілуі бұзылатын болса, адам диабет ауруына ұшырайды : глюкоза гликоген түрінде бөгеліп қалмағандықтан,қанда жүзім қантының мөлшері артады. Есептеу бойынша дүние жүзінде 60 млн. адам диабетпен ауырады, яғни ол жүрек және рак ауруларынан кейін адамның өліміне әкелетін үшінші ауру болып саналады. Диабетпен ауыратын адам тәулігіне гормонның орта есеппен 40 бірлігін қабылдауы қажет Ұйқы безінде инсулиннің түзілуі бұзылуы
ХХ ғасырдың 20-шы жылдар басында қант диабетімен ауыратын жас адамдарда, яғни инсулинді қажет ететіндерде ұзақ өмір сүруге үміттері жоқ еді. 1921 жылдың күзінде Торонто қаласында (Канада) Ф. Бантинг және Ч. Бест дәрігерлері бұзаулардың ұйқы безінен алынған белгілі заты иттерде экспериментальды диабетінде қанның қант деңгейін төмендеткен. 1922 жылдың 11 қантарында иттерге көптеген нәтижелі сынақтарынан кейін диабетпен сырқаттанатын 14 жасар ер баласына инсулиннің бірінші тарихи инъекциясы енгізілді. Келешекте олар Нобель сыйлығын алды, ал Бантингтің туған күнін Халықаралық диабет күні (14 қараша ) деп аталып өтеді.
Осы уақытқа дейін инсулиннің негізгі шығу көзі — етке өткізілген сиыр мен шошқаның ұйқы безі болатын. Сиырдың ұйқы безінің салмағы 200—500 г; кристалдық инсулиннің 100 г. алу үшін 800—1000 кг. ұйқы безі қажет. Бұдан басқа, ауру адамдардың біраз бөлігі, әсіресе балаларда бұл гормонға аллергия дамығандықтан, оларды жануар текті гормонмен емдеудің қиындығы бар. Екінші жағынан, инсулинге тәуелді адамдардың саны жылдан жылға арта түсуде. Осы себептерге орай адамның ген- инженерлік инсулинін бактерия клеткасында өндіру қажеттігі туды Дегенмен, ірі қара малдың инсулині адамдікінен үш амин қышқылды қатармен ажыратылады, шошқанікі – біреу, сондықтан науқас организмінде осындай пептидтерге қарсы антиденелер түзілуі мүмкін.
Рекомбинантты ДНҚ Рекомбинантты ДНҚ - Организмнен тыс рекомбинация әдісі, әр түрдің ДНҚ- ларын ( табиғи немесе жасанды ) бөліп алып, оларды бір-бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ- ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді Рестриктазалар – дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Лигаза – ДНҚ- ның бос ұштарын бір-біріне жалғайтын фермент. Қазір 500-ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ- ны бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни рестриктазаны тандай отырып ДНҚ-дан қалаған ферментті немесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.
Қажетті ген Донорлық ДНҚ вк Клондаушы вектор Рестриктазамен өндеу Лигазамен өндеу Рекомбинантты ДНҚ
Адам инсулин генін алғаш рет 1978 ж. « Генентек » фирмасы (АҚШ) синтездей алды. Соматостатин гені сияқты инсулиннің синтетикалық, гені плазмидаға — галактозидаза генімен, соңына енгізілді. Мұнда әрбір бактериялық клеткада инсулиннің шамамен 100 000 молекуласы синтезделді Е.СоІі клеткасында проинсулиннің биосинтезі іске асты ; ол үшін кері транскриптазаның көмегімен РНҚ-дан оның ДНҚ- көшірмесі ( кДНҚ ) синтезделді.
- А және В тізбектерді кодтайтын ДНҚ- ның химиялық синтезі ; - осындай нуклеотидтер қатары E.coli - діңбета-галактозидаза ферментінің жарты молекуласын кодтайтын lacZ геніне ендіріледі, lacZ ген pBR322 плазмида құрамында кездеседі ; - әр бір lacZ геномы және А ( немесе В) тізбегі бар плазмиданы E. с oli бөлек штамдарына ендіреді ; - өндіруші штамдарды екі бөлек биореакторларда дақылдандырады – трансформацияланған E. coli ковалентті байланысқан рекомбинантты нәруыздар молекуласын (А немесе В- тізбектері ) түзетін химерлі нәруыздар мен эшерихийлердің өзіндік нәруыздары ; - бөліп алынған химерлі нәруыздарды метионин қалдығы бойынша нәруыздарды ажырататын бромцианмен өндейді. Әрі қарай А және В тізбектері бета- галактозидаза фермент нәруызынан ажыратылады да тазартылады ; - тазартылған А және В тізбектерін дисульфидті байланыспен қосады, инсулиннің екі тізбекті биологиялық активті мономері алынады. Рекомбинантты инсулин алу технологиясы келесі сатылардан өтеді :
Бұл препарат клапандар мен насостар жүйесінен құралған, нақты белгілі бағдарлама бойынша реакциялық қоспаға нуклеотидтер мен реагенттерді енгізеді, нәтижесінде өсіп бара жатқан нуклеотидтер тізбегіне қажетті мономерлі бірліктерді қосуын қамтамасыз етеді. Биологиялыққа қарағанда ДНҚ- ның химиялық синтезі барысында тізбектің 5-штрих гидроксильді соңына әрбір жаңа нуклеотидті біріктіруге ( қосуға ) болады. Осындай барлық реакциялар компьютерлік бағдарламалармен жабдықталған бір реакциялық колонкада бір ізділікпен өтеді. ASM-800 ДНҚ синтезаторы Инсулиннің А және В тізбегін кодтайтын ДНҚ қысқа фрагменттерін, бір тізбекті олигонуклеотидтерді ДНҚ-синтезаторы көмегімен химиялық синтезде алуға болады.
Алдымен химиялық жолмен А- тізбекті және В- тізбекті кодтайтын кДНҚ – екі нуклеотидті қатарлар бөлек синтезделінеді. Әрі қарай оларды бөлек екі векторлы плазмидаға енгізеді, соңғылары екі әртүрлі E. с oli штамдарын трансформациялайды. Осындай кДНҚ фрагменттерде сигнальды ( Сп ) және дәнекерлік (С) пептидтерді кодтайтын нуклеотидті қатары жоқ. Гендік модификацияланған E. coli бөлек дақылдандырады К ейін дақылдық ортадан инсулиннің рекомбинантты нәруыздарын - А және В тізбектерін бөліп алады, О ларды химиялық реакцияда дисульфидті байланыспен біріктіреді, Т аза биологиялық активтілігі жоғары инсулин алынады. E.coli клеткасынан гендік-инженерлік инсулин алу технологиясы мүлдем өзгертілді :
Рекомбинантты инсулин алу
Америкалық «Эли Лилли» фирмасының зерттеушілері Е. СоІі клеткасының 20% көлемін проинсулин немесе инсулин алатынын атап көрсетті. Көлемі 1000 л бактерия культурасынан 200 г дейін инсулин өндіруге болады, әншейінде гормонның мұндай мөлшерін өндіру үшін сиырдың немесе шошқаның 1600 кг ұйқы безін өңдеу қажет болар еді. 1982 жылы АҚШ- тың азық-түлік өнімдері, косметикалық заттар, дәрі-дәрмектер Федералдың Басқармасы ( FD А) «Эли Лилли» компаниясы шығаратын « Хемулин » ( инсулиннің саудалық аталуы ) препаратын сатуға рұқсат берді. Ұлыбритания мен СССР-де рДНҚ технологиясы арқылы бактерия клеткасында инсулин өндіру 1980 жылдары ойдағыдай шешілді. Ген инженериясының әдістері арқылы арнайы құрастырылған бактерия клеткаларында түзілген өсу гормонының айқын артықшылықтары бар: препараттарбиохимиялық тұрғыдан таза, инфекциялық вирустар жоқ және көп мөлшерде синтездеуге болады. Қорыта келе рекомбинантты инсулин алу e. coli бактериясымен өндіру, Инсулинді қол жетімді әрі шығынды азайтып отыр. Қорытынды
Қолданылған әдибеттер: Негізгі әдебиеттер : 1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, « Білім » 1996. 2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г. 3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надеждыМосква “Мир” 1987 г. 4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г. 5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г. Қосымша әдебиеттер : 6.Новое вклонировании ДНК.Методы / Под ред. Д.Гловера.М.Мир, 1989г. 7.Льюин Б.Гены.М.Мир, 1987г. 8.Мобильность генома растений /Под ред.Б.Хон и Е.С. Деннис.М.Во “ Агропромиздат ”,1990г 9.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений.М Наука,1988г. 10.Созинов А.А. Ақуыздың полиморфизмі және оның генетика мен селекциядағы маңызы. М. Наука. 1985 ж. 272 бет.
