Взятие материала для гистологического исследования; Фиксация; Промывка объекта; Дегидратация; Заливка материала в застывающие среды; Приготовление срезов; Депарафинирование и окрашивание срезов; Дегидратация и просветление; Заключение срезов в бальзам.
кусочки органов вырезают острым ножом; вырезают кусочки органов толщиной 0,5-1,0 см; вырезая кусочек, следует учитывать гистологическое строение органа, если оно однородное (печень, селезенка), то не имеет значения, из какого места органа вырезан кусочек. Гистологическое строение таких органов, как почка, надпочечник, не одинаково на поверхности и в глубине, поэтому для того, чтобы на препарате были видны все слои органа, разрезы при взятии кусочка выполняются вглубь перпендикулярно поверхности органа.
Фиксация обеспечивает стабилизацию и уплотнение тканевых структур. Выбор фиксирующей среды зависит от задач исследования; объем фиксирующей жидкости должен превышать объем кусочков не менее чем в 20 раз; фиксацию проводят при комнатной температуре; недопустимо обмывание кусочков водой перед фиксацией (это может привести к появлению артефактов); повторно фиксатор не используют.
Жидкость Буэна Жидкость Лилли Состав: 75 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты; 25 мл формалина; 5 мл ледяной уксусной кислоты. Продолжительность – 4-24 ч. Состав: 8 г нитрата свинца; 10 мл формалина; 10 мл воды; 80 мл этанола. Продолжительность – 24 ч.
Жидкость Карнуа Жидкость Шафера Состав: 6 частей абсолютного спирта; 3 частей хлороформа; 1 части ледяной уксусной кислоты. Продолжительность – 2-3 ч. Состав: 2 части 96% спирта; 1 часть формалина. Продолжительность – 1-2 суток.
Промывка – очистка материала от фиксатора. Продолжительность – 1-2 суток.
От качества обезвоживания зависит качество заливки! Таблица 1. Приготовление спиртов различной концентрации из 96 % спирта Для получения 100 мл спирта Объем составных частей 96% спирта H 2 O 90% спирта H 2 O 8 0% спирта H 2 O 7 0% спирта H 2 O 40° 42 58 44 56 50 50 57 43 45° 47 53 50 50 56 44 64 36 50° 52 48 56 44 63 37 71 29 60° 63 37 67 33 75 25 86 14 70° 73 27 78 22 88 12 - - 80° 83 17 89 11 - - - - 90° 94 6 - - - - - -
Первая схема: этанол 80%-й – 6-8 ч; этанол 96%-й ( I ) – 12 - 24 ч; этанол 96%-й ( II ) – 4- 24 ч; этанол абсолютный – 2-4 ч (при комнатной температуре). Вторая схема: этанол 80%-й – 2-4 ч; этанол 96%-й ( I ) – 6-18 ч; этанол 96%-й ( II ) – 2-4 ч; этанол 96% ( III ) – 2-4 часа (при температуре 37°).
Протокол окрашивания гематоксилином и эозином целлоидиновых срезов: 1. Окрасить в гематоксилине в течение 2–3 мин. 2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде 2-5 мин. 3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин. 4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1,0 мин. 5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %-100 %) по 1–2 мин. 6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин. 7. Заключить срезы в бальзам.
Протокол окрашивания гематоксилином и эозином парафиновых срезов : 1. Наклеить срезы на предметное стекло. 2. Удалить парафин из срезов в трех порциях ксилола по 4-5 мин. 3. Удалить из срезов ксилол в абсолютном спирте в течение 2-3 мин. 4. Гидратировать срезы, проведя их через спирты нисходящей концентрации (96 % – 70 %) и дистиллированную воду в течение 2-3 мин. 5. Окрасить в водном растворе гематоксилина в течение 2-3 мин. 6. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде 2–5 мин. 7. Окрасить в водном растворе эозина в течение 0,5-1,0 мин. 8. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1,0 мин. 9. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %-100 %) по 1-2 мин. 10. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин. 11. Заключить срезы в бальзам.
Тинкториальные свойства – способность гистологических структур окрашиваться определенным образом теми или иными красителями. Иногда структуры, имеющие специфический химический состав, меняют при окрашивании цвет красителя. Такое тинкториальное свойство называется метахромазией.
Дегидратация – срезы обрабатывают по 5 мин в 70%, 80%, 96% и абсолютном спирте. Просветление – срезы выдерживают в карбол-ксилоле около 3 мин, перед заключением в консервирующую среду срезы отмывают в чистом ксилоле в течение 2-3 мин.
