к.м.н., доц. Перунова Н.Б. 2011
открытие появления мутаций под влиянием рентгеновского облучения Герман Джозеф Мёллер (1946) исследования нуклеотидов и нуклеиновых кислот Александер Робертус Тодд (1957) хромосомальная теория наследственности Томас Хант Морган (1933)
роль генов в специфических биохимических процессах «один ген — один фермент» Джордж Уэлс Бидл, Эдуард Тейтем (1958) генетическая рекомбинация и организация генетического материала у бактерий Джошуа Ледерберг (1958) механизм биологического синтеза рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот Северо Очоа и Артуру Корнбергу (1959)
С 1933 г. Нобелевская премия присуждалась в 17 раз 1989 г. — Сиднею Альтману и Томасу Чеку за открытие каталитической функции РНК и применение этой функции в биотехнологии
Геном бактерий состоит из генетических элементов, способных к самостоятельной репликации (РЕПЛИКОНОВ) РЕПЛИКОНАМИ ЯВЛЯЮТСЯ ХРОМОСОМА И ПЛАЗМИДЫ
БАКТЕРИАЛЬНАЯ ХРОМОСОМА (ФОРМИРУЕТ КОМПАКТНЫЙ НУКЛЕОИД) ГЕНОТИП (ДНК – В НУКЛЕОИДЕ) ПЛАЗМИДА (ВНЕ ХРОМОСОМЫ) ПЛАЗМОТИП (ДНК В ЦИТОПЛАЗМЕ) кодирует жизненно важные функции дает преимущества при попадании в неблагоприятные условия устойчивости патогенности
Хранение наследствен- ности – в форме последо-вательности нуклеотидов ДНК Каждому белку соответ - ствует свой ген ( дискрет - ный участок на ДНК) Совокупность генов – геном (определяется количеством н.п.) Геном имеет гаплоидный набор генов Бактериальная хромосома – чаще кольцевая двухцепочечная ДНК Размер хромосом варьирует
Под строгим контролем – репликация сопряжена с репликацией хромосомы (одна или несколько копий) Под слабым контролем – репликация не сопряжена с репликацией хромосомы (от 10 до 200 копий)
Нуклеиновая природа (ДНК) Автономность размножения ( эписома ) Кодирование свойств бактерий (Col, R, ALA и др. ) Регуляция функции генов хромосомы Интеграция в хромосому Сообщает клетке свойство донора Сообщает клетке иммунитет к суперинфекции Трансмиссивность - инфекционная природа
Эписомы (интегративные) Обратимо встраиваются в хромосому Коньюгативные (трансмиссивные) присущи крупным плазмидам, имеющим tra - оперон Мобилизуемые мелкие плазмиды без tra - оперона (передаются в присутствии трансмиссивных плазмид )
Генотип Фенотип Свойства Применение f + profag + r + col + ala + la + F -фактор ЛА АЛА Бактерио - циногенный фактор R -фактор Профаг Пол бактерий Конъюгация (Н fr -фактор) Лизогения Фаговая конверсия Множествен- ная устойчи - вость к анти- биотикам - Механизм формирова - ния микроб- ного биоце - ноза Механизм персис - тенции бактерий Механизм формирова - ния микроб- ного биоце - ноза Генная инженерия ( Картиро - вание хромосом) Метод химиотера - пии ( Индук - ция лизо - гении) Выявле - ние госпи - тальных штаммов Профилак - тика и терапия дисбиозов - Эпидметка Диагностика и терапия персистент - ных форм инфекции Диагностика и терапия болезней микробной этиологии
ГРУППЫ ГЕНОВ БАКТЕРИЙ ГЕНЫ «ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» - постоянно экспрессирующиеся гены ( housekeeping genes ) ГЕНЫ РОСКОШИ - индуцибельные гены ( luxury genes ) функционируют на определенных этапах онтогенеза или при попадании клетки в определенные условия ( гены лактозного оперона у некоторых бактерий, активирующиеся) при дефиците глюкозы и наличии лактозы в среде кодируют самые необходимые белки, осуществляющие основные биохимические процессы
housekeeping genes белки рибосом и т.д. кодирующие тРНК, рРНК ДНК-полимеразы, РНК-полимеразы Ферменты гликолиза
Набор минимально необходимых для автономной жизнедеятельности генов - « генов домашнего хозяйства» - постоянен для всех клеток и составляет 256 генов. Размер генома различных видов микроорганизмов определяется количеством необязательных, факультативных генов - « генов роскоши» и характеризует спектр адаптационного потенципала.
ПГЭ могут находиться как в составе хромосомы, так и в составе плазмид Вставочные ( инсерционные ) последовательности IS -элементы Транспозоны перемещаются (из одного участка репликона в другой и между репликонами ) размер 1000 н.п. содержат гены необходимые для их перемещения ( транспозаза, репрессор) обладают теми же свойствами, что IS -элементы + имеют структурные гены (синтез молекул со специфическим биологическим свойством)
инактивация участков ДНК в месте встраивания образование повреждений генетического материала клетки слияние репликонов ( встраивание плазмиды в хромосому ) распространение генов в популяции → изменение биологических свойств популяции → эволюционный процесс
ПГЭ ИНТЕГРОНЫ
Система захвата малых элементов ДНК ( генные кассеты ) посредством сайтспецифической рекомбинации и их экспрессии Кассета в 2-х формах линейная и кольцевая Интегрон состоит из консервативного участка (кодирует интегразу ) Интеграза осуществляет рекомбинацию, включая гены кассеты в интегрон Интеграция обратимый процесс Перемещение внутри одной клетки и популяции бактерий
трансдукция коньюгация трансфор-мация
Участки ДНК отличающиеся составом Г-Ц н.п. Протяженность не более 10 000 н.п. Ответственны за синтез факторов патогенности По флангам прямые повторы ДНК и IS- элементы Могут входить в составе плазмид
спонтанные (самопроизвольно) индуцированные (извне) перемещение ПГЭ действие мутагенов физические (радиация, УФЛ) химические (азотистая кислота) биологические (транспозиция – замена на аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований)
гомологичная рекомбинация (обмен между участками ДНК с высокой степенью гомологии) сайтоспецифическая рекомбинация (встраивание плазмиды в хромосому – взаимодействие между идентичными IS- элементами хромосомы и плазмиды ) незаконченная ( репликативная ) рекомбинация (транспозиция ПГЭ, сопровождаемая репликацией ДНК) РЕКОМБИНАЦИЯ – КОНЕЧНЫЙ ЭТАП ПЕРЕДАЧИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АДАПТАЦИЯ БАКТЕРИЙ ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !
ДИАГНОСТИКА : идентификация возбудителя ( I принцип - экспресс метод, бактериологический метод) ЛЕЧЕНИЕ (генная инженерия) ПРОФИЛАКТИКА ( типирование штаммов)
ММГ (метод молекулярной гибридизации) ПЦР ( полимеразная цепная реакция) ЛЦР ( лигазная цепная реакция)
+ Относительная легкость интерпретации результатов + Возможность одновременной детекции многих фрагментов ДНК ( биочипы ) - Многоэтапность - Более низкая чувствительность по сравнению с ПЦР - Техническая сложность и высокая стоимость
+ высокая специфичность + универсальность процедуры выявления возбудителей + высокая чувствительность + возможность проведения не только качественной, но и количественной оценки содержания н.к. + высокая скорость + диагностика латентных инфекций - оснащение лаборатории получение ложноположительных результатов не используется для диагностики оппортунистических инфекций - чувствительность к мутациям
Метод использует способность ДНК лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательнос-тями ДНК мишени in vitro. ЛИГАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
+ чувствительность и специфичность, сопоставимы с ПЦР + чувствительность при обнаружении точечных мутаций - чувствительность к мутациям в области лигируемых нуклеотидов - техническая сложность и высокая стоимость
Биотехнология – это область человеческой деятельности, которая характеризуется широким использованием биологических систем всех уровней в самых разнообразных отраслях науки, промышленного производства, медицины, сельского хозяйства и других сферах.
КЛЕТКИ БАКТЕРИЙ – БИОФАБРИКИ! ВЫРАБОТКА РАЗНООБРАЗНЫХ ПРОДУКТОВ (БЕЛКИ, ЖИРЫ, УГЛЕВОДЫ, ВИТАМИНЫ, ГОРМОНЫ, ФЕРМЕНТЫ, СПИРТЫ И ДР.) БЫСТРО ВОСПРОИЗВОДЯТСЯ ЭКОНОМИЧНО
Сами клетки как источник целевого продукта Крупные молекулы, которые синтезируются клетками в процессе выращивания (ферменты, токсины, антигены и др.) Первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества (аминокислоты, витамины, нуклеотиды и др.) Вторичные метаболиты ( идиолиты ) – низкомолекулярные и макромолекулярные соединения (антибиотики, алколоиды, гормоны и др.)
Генная инженерия представляет собой совокуп - ность методов, позволяющих создавать синтетические системы на молекулярно- биологическом уровне. ГИ возникла в 1972 г., когда в лаборатории П. Берга ( Станфордский ун-т, США) была получена первая рекомбинантная (гибридная) ДНК
Методы генной инженерии основаны на получении фрагментов исходной ДНК и их модификации. Для получения исходных фрагментов ДНК разных организмов используется несколько способов: Получение фрагментов ДНК из природного материала путем разрезания исходной ДНК с помощью специфических нуклеаз ( рестриктаз ). Прямой химический синтез ДНК, например, для создания зондов (молекулы ДНК с заранее известной структурой, в состав которых входят радиоактивные изотопы фосфора или водорода). Синтез комплементарной ДНК ( кДНК ) на матрице мРНК с использованием фермента обратной транскриптазы (ревертазы).
В состав вектора входит не менее трех групп генов: Гены, которые интересует экспериментатора. Гены, отвечающие за репликацию вектора. Гены-маркеры, по деятельности которых можно судить об успешности трансформации (например, гены устойчивости к антибиотикам или гены, отвечающие за синтез белков, светящихся в ультрафиолетовом свете).
Трансфекция (метод термошока ) Микроинъекция (позволяет вводить любую ДНК, не требуется селективного давления) ( Андерсон и Диакумакос,1970) Электропорация ( импульсы высокого напряжения обратимо увеличива е т проницаемость биомембран ) Упаковка в липосомы Биологическая баллистика (на мельчайшие частички вольфрама, диаметром 0,6—1,2 мкм, напыляется ДНК вектора)
В настоящее время созданы: Вакцина против гепатита В Интерлейкины -1, 2, 3, 6 Инсулин Гормоны роста Интерферон α, β, γ Эритропоэтин Антигены ВИЧ И другие………….
Плазмида Хромосома Множественная устойчивость к антибиотикам Фактор адгезии Е. coli Энтеротоксин Е. coli Фактор пенетрации Sh.sonnei Протоксин холероген Протеаза холерогена Пили общего типа Гиалуронидаза Нейрами - нидаза Протеин А Протеин М Капсула Дифтерийный токсин profag Эритрогенный токсин холероген r cfa-1 tox tox pen tox ch pro ch pil hia nei proA proM cap tox d ope tox eri
ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКА Л Е Ч Е Н И Е ПРОФИЛАКТИКА Обнаружение атипичных форм возбудителя ( L -формы и др.) Генетические методы: ДНК-гибридизация, ПЦР и др. Геносистематика Преодоление антибиотико- резистентности Создание искусственных вакцин Создание эубиотиков Генно- инженерные Генные Г Е Н Н А Я ИНЖЕНЕРИЯ
РЕКОМБИНАЦИИ М У Т А Ц И И Конъюгация ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ИЗМЕНЧИВОСТИ АДАПТАЦИИ ПОПУЛЯЦИОННЫЙ АНАЛИЗ СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ Трансфор - мация Трансдукция Спонтанные Индуциро - ванные ДИССОЦИАЦИИ
