Лекция № 7-9. Способы культивирования микроорганизмов и виды ферментации ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ. ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ К.б.н. Садвакасова А.К.
ТВЕРДОФАЗНОЕ кюветный способ выращивания кассетный способ выращивания выращивание методом объемной аэрации выращивание в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата
Лотки-кюветы после загрузки субстрата, засеянного соответствующей культурой микроорганизма, помещаются на стеллажи в специальные растительные камеры в которых поддерживаются все необходимые для культивирования условия.
в качестве «биореакторов» используют подносы из алюминия или культивационные камеры, площадью несколько м 2 ; «тонкий слой» субстрата – 3-7 см (например, солома)
1) В связи с использованием воздуха в качестве теплоносителя расход его достигает значительной величины. 2) Проблема регулирования теплообмена. Необходим постоянный контроль за температурой внутри ростовой камеры и эффективный отвод избыточного тепла. 3) В процессе культивирования наблюдается непрерывное снижение влаги в твердом субстрате. В начале влажность питательной среды 58-60%, к моменту окончания процесса 30%. Важно поддерживать влагосодержание не ниже 55-50% - предварительное увлажнение (кондиционирование) воздуха, подаваемого в растительные камеры.
Камера разделена на 23-25 секции-кассеты перфорированными перегородками с двойными стенками, между которыми подается стерильный воздух. В пространство между перегородками загружают сверху засеянную питательную среду. Стерильный воздух подводится к каждой из секций с помощью коллектора. По окончании процесса культивирования камеру разгружают путем открытия жалюзийных пластин днища камеры. Полнота разгрузки камеры обеспечивается путем установки ее на специальный вибростол. Кассетный способ выращивания позволяет вдвое увеличить толщину слоя субстрата, по сравнению с кюветным, благодаря двустороннему обдуву его потоком воздуха, что ведет к повышению эффективности процесса поверхностного культивирования.
Проводят в колонных аппаратах, разделенных на секции перфорированными пластинами, укрепленными на поворотных осях. Воздух с помощью коллектора подают под каждую секцию аппарата, а выделяющееся в ходе ферментации тепло отводят охлаждающей водой, подаваемой в наружную рубашку аппарата. Питательная среда дополнительно перемешивается и распределяется по тарелкам с помощью установленных по центру аппарата на общем валу перемешивающих устройств. Загрузка аппарата осуществляется сверху, а выгрузка через днище. При этом перегрузка среды с тарелки на тарелку и выгрузка осуществляется в результате поворота сегментных частей тарелок на угол 90 в автоматическом режиме.
масса может быть гомогенной, например, полужидкий навоз или состоять из частиц твердого субстрата, взвешенных в жидкости. Используют биореакторы с низкоскоростными мешалками. Однако перемешивание при обилии твердой фазы травмирует биообъект (нежелательно для мицелиальных грибов). Для мягкого перемешивания используют винтовые мешалки или биореактор в виде вращающегося барабана.
Протекают в аппаратах с твердым наполнителем, через который пропускают ток газа. Например, получение спирта на основе дрожжей : мелкие агрегаты дрожжевых клеток, предварительно увлажненные концентрированной питательной средой, «парят» в биореакторе в мощном потоке газа, поступающего из сопла в днище аппарата. Газ, уходящий из аппарата несет летучие продукты жизнедеятельности дрожжей, в т.ч. спирт, конденсируемый в холодильнике. Агрегаты дрожжевых клеток играют одновременно роль и биообъекта, и твердого наполнителя.
1) требуют меньших затрат на оборудование и эксплуатацию; 2) облегчены отделение и очистка продукта (благодаря характеру субстрата); 3) вероятность заражения культуры продуцента посторонней микрофлорой не высокая (из-за низкого содержания воды в субстрате); 4) сброс в окружающую среду сточных вод минимален.
1) из-за недостаточного перемешивания, рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации, при этом отдельные зоны в толще субстрата избыточно населяются клетками и возникает локальная нехватка питательных веществ, хотя значительная часть субстрата остается незатронутой. Для решения этой проблемы необходимо: - внесение большего количества посевного материала и РАСПРЕДЕЛЕНИЕ его по всему объему субстрата; - периодическое культивирование с многократным отъемом части субстрата с биомассой и внесение эквивалентного количества перемешиваемого свежего субстрата.
2 ) проблематичен контроль за эффективностью аэрации различных участков субстрата, температурой и уровнем влажности из-за неоднородности условий в толще твердого субстрата. Для решения этой проблемы разрабатывают малотравматичные режимы механического перемешивания и другие методы усиления массопередачи и теплообмена.
Глубинное культивирование
СИСТЕМЫ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Открытые системы Замкнутые системы Гомогенные Гетерогенные Одноступен-чатые Многоступен-чатые Многоступен-чатые Трубчатые Проточные С 100 %-ной рециркуляцией С механическим отделением биомассы С ростом в промежуточной фазе 31
Схема биореактора
возможность менять состав питательной среды в широком интервале значений концентраций различных компонентов, добиваясь при этом максимального выхода целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудования, в технологическом процессе значительно сокращается доля ручного труда (транспортировка питательной среды, загрузка и разгрузка аппарата) он требует меньших затрат на организацию процесса автоматизации различных стадий, предлагает более простую последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового продукта.
1 - смеситель питательной среды; 2 - колонка для непрерывной стерили зации потока питательной среды; 3 - теплообменник - выдерживатель; 4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (или посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки воздуха; 7 - ферментер; 8,9 - насосы; масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12 - головной фильтр для очистки воздуха.
При периодическом способе производства простерилизованный ферментер заполняется питательной средой, часто уже содержащей нужные микроорганизмы. Биохимические процессы в этом ферментере продолжаются от нескольких часов до нескольких дней. Периодически ферментер опорожняют, моют, стерилизуют, целевой продукт отправляют на очистку, и начинают новый цикл.
Периодическая - закрытая система культивирования - это такая система, когда хотя бы один из компонентов питательной среды или она вся не может ни поступать в систему, ни покидать её. В такой системе скорость роста микроорганизмов должна после ускорения стремиться к нулю из-за гибели микробных клеток вследствие накопления продуктов метаболизма и недостатка питательных веществ.
Периодический процесс состоит из следующих этапов: 1)стерилизация сред, биореактора и вспомогательного оборудования; 2) загрузка аппарата питательной средой; 3) внесение посевного материала (клеток, спор); 4) рост культуры; 5) синтез целевого продукта; 6) отделение и очистка готового продукта; 7) мойка биореактора и его подготовка к новому циклу.
30
29 Схема биореактора периодического действия Х – концентрация биомассы в культуре, г/л; S – текущая концентрация субстрата, г/л; P – концентрация продукта, г/л
Непрерывное культивирование микроорганизмов Открытая - непрерывная система культивирования - это система, когда все питательные компоненты могут поступать в биореактор и удаляться из него в виде продуктов синтеза микроорганизмов (антибиотики, витамины, ферменты био-масса микроорганизмов и т.д.). При этом скорость поступления питательной среды в биореактор и удаление из него продуктов синтеза или биомассы можно регулировать автоматически. 29
При непрерывном способе подача равных объемов сырья (питательных веществ) и отвод культуральной жидкости, содержащей клетки продуцента и целевой продукт осуществляется одновременно.
Принцип непрерывного проточного культивирования состоит в том, что в сосуд, где размножаются микроорганизмы, непрерывно подается свежая питательная среда и одновременно вытекает такой же объем КЖ, содержащей клетки и продукты их жизнедеятельности. ТО, основной принцип непрерывных процессов - точное соблюдение равновесия между приростом биомассы и ее убылью в результате разбавления содержимого свежей питательной средой.
1)Гетерогенная открытая непрерывная система - процесс идеального (полного) вытеснения – тубулярная культура; 2) Гомогенная открытая непрерывная система - процесс идеального (полного) смешения – с постоянным составом культуры (одноступенчатые и многоступенчатые) и меняющимся составом культуры
Реактор для выращивания микроорганизмов в процессе полного вытеснения в общем виде представляет собой трубу, расположенную вертикально или горизонтально. В один конец медленно втекает среда и посевной материал (микроорганизмы), а из другого конца вытекает КЖ.
В процессе полного смешения рост культур микроорганизмов происходит в реакторе-ферментере при интенсивном перемешивании культуральной среды с помощью мешалок ( турбулентный режим ). В любой точке ферментера все параметры среды должны быть примерно одинаковы. Этот метод культивирования, называемый еще гомогенно-непрерывным, наиболее широко применяется в аэробных процессах, как периодических, так и непрерывных.
Принцип работы турбидостата - прямой контроль концентрации биомассы. С помощью фотоэлемента и основан на измерении светорассеяния содержимого биореактора. Сигнал от фотоэлемента управляет скоростью протока жидкости, в свою очередь определяющего скорость роста культуры. Повышение концентрации клеток и соответственно светорассеяния автоматически приводят к ускорению протока жидкости, разбавляющей культуру, и, наоборот, убыль биомассы компенсируется замедлением протока. Концентрация клеток может оцениваться по другим критериям : по измерению рН (если в культуральной жидкости образуются органические кислоты), убыли субстрата накоплению продуктов жизнедеятельности.
Недостатки: невозможно достигнуть полного усвоения питательных веществ и при выделении целевого продукта они могут безвозвратно теряться или загрязнять его, усложняя процесс очистки При длительном культивировании в турбидостате возможно прилипание клеток к фотоэлементу и искажения его показаний. Преимущества: если засевается смешанная культура, то в турбидостате автоматически отбирается более быстро растущий вид, что может использоваться для предохранения его от заражения посторонней микрофлорой (если, конечно, она растет медленнее) и селекции определенных форм.
Принцип работы хемостата: в биореактор с постоянной контролируемой скоростью вливают ПС, при этом один из компонентов (обычно кислород) поступает в количестве, не достаточном для обеспечения максимальной скорости роста культуры. В результате реактор с биообъектом приобретает свойства саморегулирующейся системы. Например, если скорость разбавления и вымывания биомассы превышает скорость роста клеток, то наступает разбавление культуры свежей средой. Это ведет к повышению концентрации компонента, ограничивающего рост, вследствие чего скорость роста культуры увеличивается. В реакторе начинает концентрироваться биомасса. Увеличивающаяся популяция клеток активно использует субстрат, его концентрация падает, что ведет к торможению роста культуры.
Устройство хемостата: 1) устройство для вливания питательной среды; 2) выпускное приспособление для оттока культуральной жидкости с клетками; 3) система контроля скорости притока.
Самый простой вариант хемостата включает: насос, постоянно нагнетающий питательную среду в биореактор, выпускную трубу, по которой жидкость из биореактора вытекает, как только ее уровень поднимается выше горловины этой трубы. Существуют другие типы хемостатов : -основанные на радиоактивном контроле уровня жидкости; использовании метода взвешивания биореактора ; фотоэлектронных устройств и др.
Недостатки: - обычно не удается получить продукты в достаточно высокой концентрации и добиться полной утилизации питательных веществ. - в таких аппаратах невозможно или очень трудно и неудобно использовать неразмножающиеся клетки, споры или чистые ферменты. Вымываемые из ферментера клетки или ферменты практически невозможно регенерировать (отделить, промыть, вернуть в аппарат) без потери активности и с сохранением асептики.
В последнее время все чаще начинают использовать методы, занимающие промежуточное положение между непрерывным и периодическим культивированием (полунепрерывное культивирование):
Полунепрерывный отъемно-доливной метод, когда в течении всего процесса периодического культивирования часть одержимого биореактора периодически изымается и добавляется равное количество свежей питательной среды. Такой прием обеспечивает регулярное «омолаживание» (обновление) культуры и в 2-3 раза задерживает (отдаляет) ее переход в фазу отмирания. Недостаток состоит в том, что доливы осуществляют питательной средой полного состава, что неприемлемо для синтеза вторичных метаболитов.
1. Культивирование является основной стадией технологического процесса. 2. При производстве биопрепаратов наиболее широко применятся глубинное культивирование микроорганизмов. 3. Технологический процесс глубинного культивирования является многоэтапным и требует тщательного контроля. 4. При периодическом культивировании развитие микробной культуры происходит в виде последовательных фаз, характер и продолжительность которых зависит от многих параметров. 5. Применение непрерывного культивирования позволяет управлять процессом, а при необходимости вмешиваться в этот процесс.
