Цитология микроорганизмов
Прокариоты, лишенные клеточной стенки Thermoplasma acidophilum Представители микоплазм
Компоненты клеточной стенки Грамположительные эубактерии Грамотрицательные эубактерии внутренний слой ( пептидогликановый ) внешний слой (наружная клеточная мембрана) Пептидогликан + + – Тейхоевые кислоты + – – Полисахариды + – + Белки ± – + Липиды ± – + Липополисахариды – – + Липопротеины – ± + Обозначения: (–) — отсутствуют, (+) — присутствуют, (±) — присутствуют не у всех видов 1884г. датский ученый Ганс Кристиан Йоахим Грам Дифференцировка прокариот методом Грама Основной краситель: кристаллический фиолетовый Фиксатор: раствор йода Дополнительный краситель: фуксин
Пептидогликан и его компоненты Тейхоевые и тейхуроновые кислоты Липополисахариды Белки S- слоя Белки и гликопротеины псевдомуреина архей
Структура повторяющейся единицы пептидогликана клеточной стенки бактерий Цифры в кружках обозначают: 1, 2 - места полимеризации гликанового остова молекулы; 3 - место присоединения с помощью фосфодиэфирной связи молекулы тейхоевой кислоты в клеточной стенке грамположительных эубактерий; 4, 5 - места, по которым происходит связывание между гликановыми цепями с помощью пептидных связей; 6 - место ковалентного связывания (пептидная связь) с липопротеином наружной мембраны у грамотрицательных эубактерий; 7 - место действия лизоцима.
Пространственная организация пептидогликана Олигопептиды N -ацетилмурамовая кислота N -ацетилглюкозамин
Синтез пептидогликана UDP - уридиндифосфат; PEP - фосфоенолпируват; - N- ацетилглюкозоамин; - N- ацетилмурамовая кислота. сборка полимеризация перенос цитоплазма мембрана периплазм
Клеточная стенка грамположительных бактерий пептидогликан цитоплазматическая мембрана цитоплазма белки тейхоевые к-ты липотейхоевые к-ты пептидогликан ЦПМ фосфолипиды
Структура пептидогликана грамположительных бактерий N- ацетилглюкозамин ( NAG) N- ацетилмурамовая кислота ( NAM) Аминокислоты боковой цепи Поперечные аминокислоты Пептидная связь Цепь тетрапептида Связующий пептид Углеводный остов
Группы пептидогликанов грамположительных бактерий: Аминокислота в положении 3 ' аминокислотной цепи, Положение межпептидного мостика (3 ' - 4 ' или 2 ' - 4 ' ), Состав межпептидного мостика
Тейхоевые кислоты Представляют собой полимеры глицеролфосфата или рибитолфосфата n n ундекапренилфосфат N- ацетилглюкозамин N-ацетилмурамовая кислота глицеролфосфат рибитолфосфат аминокислоты фосфат P P CMP CMP CMP CDP
Отличия липотейхоевых кислот Представляют собой полимеры 1,3-глицеролфосфата, связанного с 1,3-диацилглицеролом Синтез: две молекулы глюкозы переносятся на диацилглицерол. Далее на него переносится глицеролфосфат с фосфатидилглицерола
Клеточная стенка грамотрицательных бактерий пептидогликан цитоплазматическая мембрана цитоплазма наружняя мембрана О-полисахарид Липид А наружняя мембрана пептидогликан ЦПМ белок белок порин фосфолипиды липопротеин
ЛПС можно разделить на 3 фрагмента: Липид А, является эндотоксином и содержит 2 ацилированных остатка глюкозо-N-ацетилфосфата Сердцевинный компонент состоит из кето-дезоксиоктоновой к-ты, гептоз и нейтральных сахаров, например галактозы. Наружная О-цепочка (О-АГ) состоит из последовательностей сахаров (от 2 до 8) повторяющихся многократно.
Сборка ЛПС О - полисахарид- P-P-undec + олигосахарид- Kdo- липид А = ЛПС Процесс катализируется лигазой ( RfaL/RfaT)
Порины Специфические – за перенос определенных субстратов (фосфат – PhoE) Общие – за перенос мелких молекул ( OmpC, OmpF)
Признак Основная категория I Основная категория II Цитологические признаки окраска по Граму наличие наружной мембраны кислотоустойчивое окрашивание образование эндоспор рост в виде нитей, состоящих из гиф с истинным ветвлением - + - D - + - D D D Движение -встречается скользящее движение D - Химические признаки -процентное содержание липидов -присутствие тейхоевых или липотейхоевых кислот -липополисахариды -присутствие 2-кето-3-дозоксиоктоната -содержание пептидогликана -присутствие миколовых кислот -присутствие фосфатидилинозитол манноззидов -фосфосфинголипиды 11-22% - + D <10% - - D <4% D - - >10% D D - Метаболические признаки -получение энергии за счет окисления железа, серы, соединений азота D - Обозначения: «+» – положительные, «-» – отрицательные, « D » – различные Некоторые дифференцирующие признаки основных категорий бактерий
Грамположительные и грамотрицательные бактерии Грамположительные Грамотрицательные Цитоплазматическая мембрана Периплазматическое пространство Пептидогликан Цитоплазматическая мембрана Периплазматическое пространство Пептидогликан Наружная мембрана (липополисахариды и белки)
Клеточные стенки архей и бактерий Архейный тип Бактериальный тип Грамположительная Грамотрицательная
Муреиновый тип пептидогликана: NAG + NAM Наибольшее разнообразие межпептидного хвоста у грамположительных бактерий У архей псевдомуреиновый тип пептидогликана: NAG + NATAU NAGal + NATAU
Группы прокариот Археи Б актерии Пептидогликановые гетерополимеры их клеточных стенок Псевдомуреин Муреин Структурные элементы гликановой составляющей N-ацетилглюкозамин и N-ацетилталозаминуроновая кислота N-ацетилглюкозамин и N-ацетилмурамовая кислота Характер связи между сахарными остатками β-1,3-гликозидная β-1,4-гликозидная Структурные элементы пептидной составляющей: L-аминокислоты D-аминокислоты особые диаминокислоты, не встречающиеся в составе белков аланин, глутаминовая кислота, лизин - - аланин, лизин аланин, глутаминовая кислота мезо-диаминопимелиновая и диаминомасляная кислота Клеточные стенки архей и бактерий
Клеточная стенка микобактерий Капсуло-подобный материал Арабиногалактан Пептидогликан Мембрана Вста-вочные липиды Араби-ноза Галак-тоза Маннозная головка Арабиноза Маннозное ядро Якорь фосфотидилиноситола Белки N- ацилмурамовая кислота N- ацетилглюкозамин Галактоза Манноза Арабиноза L- рамноза Липоарабиноманнан Слой миколиевых кислот
Различаются по длине, числу двойных связей, заместителей.
крист. фиолетовый йод спирт фуксин Добавление кристалли-ческого фиолетового Добавление йода Отмывка спиртом Добавление фуксина 1 2 3 4 Основные этапы окраски по Граму
CV CV Cl- CV+ Cl- CV+ Основной краситель – генциан фиолетовый
I CV+ I CV+ Протравитель – раствор йода
Этанол CV-I CV-I Этанол Обесцвечивание – отмывка этанолом
CV-I Вымывание основного красителя у грамотрицательных бактерий
CV-I Фуксин Фуксин Дополнительный краситель – фуксин
CV-I Фуксин Результат окраски по Граму
Физический способ фиксации: Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за рёбра мазком кверху и плавным движением проводят 2—3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96 % и наркозного эфира в соотношении 1:1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96 % — 60 %, хлороформа 30 %, ледяной уксусной кислоты 10 %). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом на 10—15 минут и затем высушивают на воздухе. Способы фиксации
На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2—3 минуты. Сливают краску. Мазок заливают на 1—2 мин раствором Люголя или йодистым раствором по Граму на 1—2 минуты до почернения препарата. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96° этиловым спиртом или ацетоном, пока и мазок не обесцветится и стекающая жидкость не станет чистой (приблизительно 20—40—60 секунд). Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1—2 мин. Для выявления грамотрицательной группы бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранином (2—5 мин). Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой. Грамположительные Грамотрицательные Фиксация Крист. фиолетовый Раствор йода Обесцвечивание Фуксин Методика окраски по Граму
Окрашенные бактериальные клетки
Антигены грамотрицательных бактерий Пептидогликан Внутренняя мембрана Наружняя мембрана Липопротеины Ундекапренилфосфат с сахарами Фосфолипиды МФО Периплазматическое пространство Липид А Внутре-нее ядро Наруж-нее ядро О-антиген Липополисахариды
Структура Kdo2- липида А
