МИКРОСКОПИЯ
Световые микроскопы
Микроскоп (от греч. micros – малый, scopein – рассматривать, наблюдать) – оптический прибор для получения сильно увеличенных изображений объектов, невидимых невооруженным глазом, имеющий как минимум две ступени увеличения изображения объекта. Любой тип современного микроскопа можно представить как оптико-механо-электрический прибор, объединяющий в себе три функциональные части: - визуализирующая (наблюдательная) часть; -воспроизводящая часть; -осветительная часть. Микроскопия совокупность методов зрительного исследования микрообъектов при увеличениях от нескольких десятков до сотен тысяч раз.
УСТРОЙСТВО МИКРОСКОПА
Объектив Объектив предназначен для создания увеличенного изображения в определенной плоскости рассматриваемого объекта с требуемым качеством, разрешением и цветопередачей. Окуляр Окуляры предназначены для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. Окуляры играют роль лупы, дополнительно увеличивающей изображение, созданное объективом. Конденсор – относится к осветительной системе, концентрирует свет на образце.
РАЗРЕШАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ МИКРОСКОПА Разрешающая способность – это способность оптического прибора различать мелкие детали. Предел разрешения – наименьшее расстояние между двумя точками, которые различаются как две отдельные точки. Разрешающая сила связана обратной зависимостью с пределом разрешения. Чем меньше предел разрешения, тем выше разрешающая способность микроскопа. ……………..
0,61 λ NA NA - числовая апертура характеризует светособирательную способность λ (лямбда) - длина волны света (550 нм) Понятие разрешающей способности было введено Э.Аббе в 1873 году. РС =
NA = n · sin 1/2 α Числовая апертура Числовая апертура определяет способность оптической системы воспринимать количество света. Численное значение апертуры объективов всегда выгравировано на их оправах и указывается в справочниках.
NA = n · sin 1/2 α n – показатель преломления среды между фронтальной линзой объектива и покровным стеклом α - апертурный угол Числовая апертура
оптическая ось Апертурный угол линзы ход лучей источник света α
0,61 λ n · sin 1/2 α РС =
n воздуха - 1,00 n воды – 1,33 n глицерина – 1,47 n кедрового (иммерсионного) масла – 1,51 Показатель преломления среды
λ (лямбда) Длина волны света Белый свет - смесь, спектр, полоса волн в диапазоне примерно 350нМ - красный, до 850нМ - фиолетовый.
Сравнительная характеристика разрешающей способности различных микроскопов: Световой микроскоп - 200 – 500 нм Люминесцентный микроскоп – 100 нм Лазерный конфокальный микроскоп – 20 нм Электронный микроскоп – 0,2 – О.5 нм
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра УМ =Уоб У ок
ТАБЛИЦА МАРКИРОВКИ ОБЪЕКТИВОВ NA 0,65 1,3 Увеличение Х40 Х100 Истинное увеличение 40Х 100Х Толщина покровного стекла 0,17 0,17 Тип иммерсии: МИ - масляная иммерсия – черное кольцо ВИ - водная иммерсия – белое кольцо Дополнительная буквенная маркировка метода исследования: Ф – фазовой контраст П – поляризованный свет Л – люминесцентный метод исследования ФЛ – фазово-люминесцентный метод ДИК – дифференциально-интерференциальный контраст ЭПИ – объективы для работы в отраженном свете
ГЕПАТОЦИТ (электронная микроскопия)
Клетка миокарда крысы, основная культура (метод VAREL) Инвертированный микроскоп В инвертируемых микроскопах рабочее расстояние может доходить до 200 мм.
Темнопольный микроскоп позволяет обойти трудности, связанные с тем, что живые материалы прозрачны. Образец в нем рассматривается при столь «косом» освещении, что прямой свет не может попасть в объектив. Изображение формируется светом, дифрагированным на объекте, в результате использования в оптической схеме микроскопа темнопольного конденсора. Объект выглядит очень светлым на темном фоне (с очень большим контрастом). В 1903 году Австрийские исследователи Р. Зигмонди и Г. Зидентопф создали ультрамикроскоп (темнопольный микроскоп).
Назначение Темнопольный микроскоп позволяет увидеть более мелкие объекты (до 20 ангстрем), чем обычный, но с очень низким разрешением. Наблюдение за объектами в темном поле позволяет исследовать только контуры клеток, или отдельных структур, не давая возможности рассмотреть их внутреннее строение. Повседневное применение в клиниках при диагностировании инфекционных заболеваний. Исследования в области микробиологии, протистологии, гематологии, гинекологии, урологии и дерматологии.
Схема темнопольного микроскопа. Свет от осветителя 1 и зеркала 2 направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля 3. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив 5 (который находится внутри этого конуса). Изображение в М. создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле 4 препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения 6 на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света.
Клетки дрожжей Candida albicans Этот метод найден в 1935 году голландским физиком Ф.Цернике.
Применяется для исследования прозрачных объектов, особенно живых клеток. Особенную ценность представляет метод фазово-контрастной микроскопии для исследования клеток, культивируемых in vivo. В этом случае при помощи цейтрафферной микрокиносъемки можно регистрировать, а затем изучать различные изменения, происходящие в цитоплазме и ядре во время деления и движения клеток, непрерывное движение митохондрий, вакуолей (пиноцитоз) и различных включений, образование тонких мембран и нитевидных отростков, прорастание спор микроорганизмов и т.п. Фазово-контрастная микроскопия используется для изучения действия химических и физических агентов на животную клетку, а также для выявления артефактов, возникающих в результате применения различных способов фиксации и окрашивания. Назначение
Основные условия освещения фазово –контрастного микроскопа: обычный прямо проходящий свет перекрывается, но в два этапа – часть света до объекта, а затем после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослаблением. При этом свет в виде светового кольца определенной площади проходит через объект, а затем – через полупрозрачное кольцо в объективе.
Световой микроскоп Фазово –контрастный микроскоп Плоский эпителий внутренней поверхности щеки
Фазово –контрастный микроскоп Микроскоп светлого поля
Основной принцип действия флуоресцентного микроскопа
Срез мозжечка мыши, окрашенный несколькими красителями
Конфокальный микроскоп — оптический микроскоп, обладающий значительным контрастом по сравнению с обычным микроскопом, что достигается использованием апертуры, размещённой в плоскости изображения и ограничивающей поток фонового рассеянного света.
Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области. Marvin Minsky 1957
Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива (для подсветки и сбора отраженного сигнала).
Схема функционирования LSCM
Стволовая клетка
Гепатоциты, подобно амёбе, поглощают Т-лимфоциты и расщепляют их внутри себя.
1931 - 1933 НОБЕЛЕВСКАЯ ПРЕМИЯ 1986 «за фундаментальные работы по электронной оптике и создание первого электронного микроскопа» МАКС КНОЛЛЬ И ЭРНСТ РУСКА
ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА ЭРИТРОЦИТА (по данным электронной микроскопии) ПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ МЕМБРАНА ЭРИТРОЦИТА (по данным электронной микроскопии)
