Слева направо: Цитоплазматический и ядерный пути для стероидов Мембранный цАМФ путь Мембранный ИФ3 путь Тирозинкиназный путь Мембранный и цитоплазматический цГМФ путь
Передача сигнала посредством внутриклеточных рецепторов
1.СГ → СГ+белок-переносчик →по кровотоку к клетке-мишени → диссоциация комплекса → диффузия СГ внутрь клетки-мишени → связывание с рецептором в цитоплазме или ядре. 2. Рецептор ( Рц ) СГ (50-120 кДа ) содержит несколько доменов: гормонсвязывающий (Е), ДНК-связывающий (С), сайт-специфический домен ( D ). Домены участвуют в узнавании гормон-респонсивных элементов ( HRE) и связывании Р с ДНК. Регуляторный домен A/B содержит участки связывания с различными компонентами клеточного ядра для компарментализации Рц. 3. В неактивном состоянии РцСГ находится в комплексе с белком-ингибитором. 4. СГ+ белок-ингибитор (БТШ 90) → связывание с Рц → конформационные изменения → диссоциация комплекса → димеризация Рц → повышение сродства к ДНК → комплексы РцСГ связываются с энхансерными участками ДНК ( HRE) → инициация транскрипции → синтез белков
Пути образования и проведение сигнала ( цАМФ, цГМФ, NO, липидные мессенджеры )
Вторичные посредники – это низкомолекулярные вещества, небелковой природы, образуются и действуют внутри клеток, и обеспечивают передачу сигнала от рецептора к мишеням в клетке. ВП синтезируются de novo или хранятся во внутриклеточных депо, выходя в цитоплазму при активации рецепторов. Критерии, предъявляемые к ВП: 1 ) ВП действуют внутри клетки; 2) в клетке имеется механизм синтеза и метаболизма ВП; 3) в неактивированной клетке концентрация ВП низкая и резко увеличивается при активации рецепторов. 4) ВП значительно усиливает первичный сигнал; 5) в клетке должны существовать специфические мишени ВП; 6) антагонисты действия ВП должны блокировать эффект активации рецептора; 7 ) ВП компартментализован в клетке, что направляет и ограничивает сигнал.
Вторичные мессенджеры : циклические нуклеотиды ( цАМФ, цГМФ ), мембранные липиды и их производные (ИФ3, ДАГ), ионы (Са2+), оксид азота, гидропероксид NO • Оксид азота Н 2 О 2 Гидропероксид
Ключевые этапы передачи сигнала посредством ВП являются общими для регуляторных систем: агонист →рецептор→ эффекторный белок→вторичный посредник→модулируемый белок→физиологический эффект Эффекторные белки – это белки, запускающие образование вторичных посредников. GPCRs передают сигнал на эффекторные молекулы – аденилатциклазу, фосфолипазу С, фосфолипазу А2, цГМФ-специфическую фосфодиэстеразу и несколько типов ионных каналов.
G- белки Gs- белки Gi- белки Gq- белки Gs, Gi, Gq, Go- белки RAS- белок Каскад MAP- киназ Транскрипцион-ные факторы (CREB) Тканеспецифическое действие на транскрипцию, пролиферативный сигнал ↑ АЦ ↑ цАМФ ↓ АЦ ↓ цАМФ ↑ ФЛ-С δ, β ↑ ДАГ, ИФ3, Ca 2+ ПК С Ионные каналы Доминантные метаболические пути ПК А Raf(MAPKKK)
Существует 2 пути, с помощью которых GPCRs запускают образование вторичных посредников: сАМР – путь : активация GPCRs → активация G s - и G i -белков → активация аденилатциклазы (АС) → синтез сАМР → активация ПКА → фосфорилирование ФТ → экспрессия генов 2. Са 2+ / ДАГ- путь: GPCRs →активация G q - белков → активация фосфолипазы С β ( PLC β ) → образование фосфоинозитол – 1,4,5- трифосфата ( IP 3 ) → выход ионов Ca 2+ из ЭПР; PLC β → образование диацилглицерола (ДАГ) → → активация ПКС → фосфорилирование мишеней
Циклический АМФ ( цАМФ ) - важнейший ВП, это вещество «влияет на все – от памяти до кончиков пальцев» ( Э.Сазереленд ) Образование и распад цАМФ
Интегральный белок плазматической мембраны Гликопротеин, М – 110-180 кДа Полипептидная цепь содержит 12 трансмембранных доменов Два домена Т1(М1) и Т2(М2) состоят из 6 трансмембранных спиралей, N- и С-концы экспонированы в цитозоль 5. Каталитическая часть (цитоплазматическая) включает 2 домена К1 и К2, образующие участки связывания для АТР и α -субъединицы G s и G i - белков
Упрощенная схема активации АЦ вследствие связывания гормона (адреналин, глюкагон) с рецепторм, сопряженным с G -белком
Активируют аденилатциклазу Ингибируют аденилатциклазу АКТГ АДГ Кальцитонин Кортиколиберин ФСГ ЛГ Глюкагон Адреналин ( β - адренэргические рецепторы) ТТГ -ацетилхолин -адреналин ( α 2-адренэргические рецепторы) - ангиотензин II - соматостатин
Образование вторичного посредника цГМФ катализируется гуанилатциклазами
1. ГЦ катализирует образование вторичного посредника цГМФ из ГТФ. 2. В клетке имеется 2 формы ГЦ – мембраносвязанная ( мГЦ ) и растворимая ( рГЦ ). 3. Соотношение форм ГЦ в тканях разное: в клетках кишечника – 90% мГЦ, в легких и печени – 20% мГЦ. 4. рГЦ - димер ( α + β -сб.), простетическая группа – гем, активируется NO и АФК. 5. мГЦ – трансмембранный гликопротеин, относится к рецепторам, сопряженным с ферментативной активностью. Различают 3 изоформы мГЦ, которые активируются различными регуляторами: предсердным натрийуретическим фактором, натрийуретическим пептидом мозга, кишечным пептидом гуанилином. 6. В клетках выявлено 3 типа эффекторных белков, с которыми взаимодействует цГМФ : цГМФ-зависимая ПК (ПК G), цГМФ-регулируемые ионные каналы, цГМФ-зависимая фосфодиэстераза.
Механизм действия цГМФ Молекулярные мишени для цГМФ Тип клеточного ответа Примеры Ионные каналы Изменение проницаемости Фоторецепторы: открываются катионные каналы Почки: ингибируется Na- канал цГМФ-зависимые протеинкиназы Фосфорилирование Гладкомышечные клетки: [Ca] Тромбоциты: [Ca] цГМФ-активируемая фосфодиэстераза Снижение [ цАМФ ] C ердце : уменьшается поток ионов Са Гиппокамп:уменьшается поток ионов Са (формирование памяти) цГМФ-ингибируемая фосфодиэстераза Увеличение [ цАМФ ] Гладкомышечные клетки: [Ca] Тромбоциты: [Ca]
Структура мембранной гуанилатциклазы
Схема активации растворимой гуанилатциклазы оксидом азота
1. В неактивированном состоянии гем гуанилатциклазы связан координационно с четырьмя атомами азота центрального кольца гема, а также образует пятую координационную связь с His-105 β -субъединицы. 2. Взаимодействие с NO приводит к образованию неустойчивого шести координационного гистидин-гем-NO промежуточного продукта. При этом атом железа гема выступает из плоскости порфиринового кольца и разрывается связь между His-105 и железом гема. Образуется пятикоординационный нитрозил-гемовый комплекс – истинный активатор растворимой гуанилатциклазы. 3. YC-1 замедляет диссоциацию NO от гуанилатциклазы и повышает чувствительность феpмента к активации оксидом азота. YC–1 (3-(5′-оксиметил-2′-фурил)-1-бензилиндазол), который является не только NO-независимым активатором фермента, но и усиливает активацию фермента донорами оксида азота. Активации растворимой гуанилатциклазы оксидом азота (NO )
Схема активации зрительного каскада и регуляция цГМФ-активируемых натриевых каналов
NO как вторичный посредник. Биосинтез оксида азота и структура нейрональной NOS FMN, В H 4, гем NOS : NADFH, FAD L -аргинин + О 2 L - цитруллин + NO •
Строение NO- синтазы
Фосфорилированием - ПКА - ПКС - Са / кальмодулин-зависимой киназой Дефосфорилированием - фосфатазой 1 • Диссоциацией димерной формы, мономерная форма NOS приобретает супероксидсинтетазную активность (становится прооксидантным ферментом)
вазодилятацию нейротрансмиссию макрофагальную цитотоксичность релаксацию гладкомышечных клеток ЖКТ бронходилятацию модуляцию ЭТЦ митохондрий модуляцию апоптоза снижение концентрации цитоплазматического Са2+ цАМФ-зависимые процессы
Роль NO в работе возбуждающего нейрона
Л ипидные вторичные посредники образуются путем расщепления эфирных связей фосфолипидов фосфолипазами
ФЛ - гидролазы, катализирующие катаболизм глицеро-фосфолипидов. Различают: 1) секреторные ФЛ ( панкреа-тический сок); 2) клеточные ФЛ. Клеточные ФЛ: А 1, А 2, С, D, различаются по специфичности к отщепляемой группе, Са 2+ -зависимые. ФЛС катализирует расщепление фосфоэфирной связи в гдицерофосфолипидах, выделено 10 изоформ, все имеют гидрофобный домен или гидрофобный якорь для ассоциации с мембраной. Многие ФЛ специфичны относительно фосфоинозитолов. При гидролизе фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (ФИФ 2 ) образуются продукты диацилглицерол (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3), служащие вторичными посредниками в трансмембранной передаче сигнала по инозитолфосфатному пути. Субстатом ФЛ может быть фосфатидилхолин.
Мембранные липиды и их производные: инозитол-1,4,5-трифосфат и 1,2-диацилглицерол
ФИ-4-киназа → ФИ → ФИ-4-фосфат (ФИФ) → ФИ -5-киназа → ФИ-4,5-дифосфат (ФИФ2) → ФЛС → два вторичных посредника (ВП): → диацилглицерол (ДАГ) (мембранный ВП) → инозитол-1,4,5-трифосфат (ИФ3) ( цитозольный ВП)
1.Известно 3 класса ФЛС: ФЛС β, ФЛС γ, ФЛС δ, которые включают 16 изоформ. 2. ФЛС β активируется G- белками ( α G q, βγ G i, G o ); ФЛС γ активируется фосфорилированием рецепторной тирозинпротеинкиназой (РТП). 3.Активация ФЛС γ : активация РТП→ димеризация рецептора→ трансавтофосфорилирование остатков Тир на цитоплазматическом домене рецептора→ создание «посадочных» мест для ФЛС γ→ закрепление ФЛ вблизи субстрата, встроенного в плазматическую мембрану. 4.Структура ФЛС : каталитический домен, разделенный на две части – X и Y, домены РН, С2, EF- руки. ФЛС δ включает только эти домены. В ФЛС β имеется длинный С-конец, связывающий ее с мембраной для регуляции α G q. В ФЛС γ X и Y компоненты каталитического домена разделены домена-ми SH2 и SH3.
1.Начальное связывание ФЛС с мембраной происходит через домен РН (сродство к фосфатидилинозитолам ). 2.Приведение каталитического участка в контакт с субстра-том : - домен С2 → ФЛС δ ; - домен С2 + α G q, βγ G i, G o → ФЛС β - домены SH2 ( взаимодействие с фосфоТир РТП), домен SH3 ( взаимодействие с пролиновыми мотивами РН и каталитического доменов) → ФЛС γ
Са 2+ -единственный вторичный посредник, функционирующий во всех типах живых клеток
Различают 3 состояния Са2+ в клетках нескелетообра-зующих тканей: 1.Са2+, локализованный внутри клеточных органелл (ЭПР, митохондрии, ядро, секреторные гранулы, лизосомы); 2. Хелатированный Са2+, т.е. ассоциированный с анионом или цитоплазматическим Са-связывающим белком; 3. Свободный, или ионизированный Са2+, находящийся в ра - вновесии с хелатированным. 4.Свободный Са2+ (0,1%) – универсальный вторичный посредник (мышечное сокращение, сердечная деятельность, активность нервной системы, коагуляция крови, тромбогенез, иммунный ответ, пролиферация, дифференцировка, апоптоз, оплодотворение)
1. Са 2+ - неметаболизируемый (стабильный) катион и его внутриклеточной уровень регулируется путем изменения концентрации, а не химической модификацией. 2. Са2 +, связывающие белки делятся на : 1)интегральные мембранные белки ( Са-каналы, Са-насосы, Na+/Ca2+ - ионообменник), осуществляют «активное» забуферивание Са2+; 2)пул внутриклеточных Са-депонирующих белков (имеют специфический Са-связывающий сайт), осуществляют «пассивное» забуферивание уровня Са2+ в цитозоле ; 3)растворимые (« триггерные ») Са-связывающие белки – компоненты Са-зависимых сигнальных систем, регулирующих активность эффекторных молекул. в покое концентрация Са2+ в клетке мала, под действием первичного мессенджера Са2+ из среды и депо поступает в цитозоль, его концентрация ↑, после выключения сигнала системы «активного» и «пассивного» забуферивания ↓ концентрацию Са2+ до нормы.
Выделяют 3 группы Са2+-связывающих белков: 1.Е F-hand- белки (цитоплазма, ядро)- содержат EFH- фраг-мент (2-6) EFH -домен (40 А),содержит петлю из 12 А, расположенную между двумя (Е и F) α -спиралями, связывает 1 ион Са2+ 2.Са2+-фосфолипид-связывающие белки (цитоплазма, биомембрана, ядро): аннексины белки, содержащие С2-фрагмент 3.Са2+-запасающие белки – ( кальцисомы - ЭПР, СПР, мито-хондрии, ядро)
Са 2+ - связывающие белки
НАДФН-оксидаза Электрон-транспортная цепь митохондрий Электрон-транспортная цепь микросом Ксантиноксидоредуктаза (КОР) Супероксиддисмутаза Пути удаления перекиси водорода: Каталаза Глутатионпероксидаза Пероксиредоксины
Строение флавоцитохрома b 558 НАДФН → ФАД → ФАДН • → гем ( внутр ) → гем ( внеш ) → О 2 → О 2 ‾•
Механизм активации NOX1-3 на плазматической мембране: лиганд →РТП→ФЛС γ→ ПКС→ фосфорилирование цитозольных белков-регуляторов→сборка НАДФН-оксидазного комплекса→продукция О 2 ‾• и Н 2 О 2 лиганд →РТП→ Ras -белок→ПК→ фосфорилирование цитозольных белков→сборка НАДФН-оксидазы
Электрон-транспортная цепь митохондрий (5-6% АФК)
Образование О 2 ‾• и Н 2 О 2 в системе микросомального окисления (75% АФК) Главной функцией монооксигеназ является детоксикация ксенобиотиков путем гидроксилирования : ХН + О 2 + АН 2 → ХОН + Н 2 О + А, где Х – ксенобиотик, АН 2 – донор электронов.
Ксантиноксидоредуктаза – источник перекиси водорода в клетке Ксантиноксидоредуктаза представлена двумя изоформами : ксантиндегидрогеназой (КД) и ксантиноксидазой (КО). КД КО – это группа из двух близких по структуре Mo 6+ и Fe 2+ -содержащих ферментов. Данные изоферменты локализованы в большинстве органов, обладают широкой субстратной специфичностью. Они окисляют пурины (через гипоксантин и ксантин до мочевой кислоты), пиримидины, адреналин, дегидрируют НАДН, НАДФН.
Схема катаболизма пуринов, катализируемого ксантиноксидоредуктазой. Ксантиноксидаза – источник перекиси водорода
Схема функционирования ксантиноксидоредуктазы
Супероксиддисмутазы (СОД) – суперсемейство ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз и катализирующих реакцию дисмутации супероксидного анион-радикала с образованием перекиси водорода и кислорода: О 2 ‾• + О 2 ‾• → Н 2 О 2 + 3 О 2 СОД присутствуют у всех аэробных организмов. СОД ( эритрокупреин ) была открыта Мак-Кордом и Фридовичем в 1969 г. СОД классифицируют по строению активного центра и структурной организации молекулы. Выделяют 3 семейства СОД: - Cu,Zn - СОД (эукариоты, хлоропласты растений, бактерии) - Fe -СОД, Mn - СОД (прокариоты, митохондрии эукариот, хлоропласты) - Ni- СОД ( Streptomyces, цианобактерии ) Супероксиддисмутазы
Структура различных изоферментов СОД
Mn - СОД и АФК- сигналинг
1. Каталаза – гемсодержащий внутриклеточный фермент ( тетрамер ): 2Н 2 О 2 → 2Н 2 О + О 2 2. Глутатионпероксидаза – конститутивное семейство ферментов, которые способны восстанавливать органические и неорганические гидропероксиды до гидроксисоединений или других восстановленных эквивалентов. Имеются селеновые и неселеновые ГПО. Селеновые ГПО содержат в активном центре селеноцистеин, который вовлекается в каталитический цикл. 2GSH + H 2 O 2 → GSSG + 2 H 2 O 3. Пероксиредоксины – цитозольные белки, обладающие перксидазной активностью, которые имеют фиксированные цистеиновые остатки на концах молекул, восстанавливают Н 2 О 2
Предполагаемый механизм действия перекиси водорода и ее мишени в клетке: тирозиновые фосфатазы (ингибирование), тирозиновые киназы (активация)
