2015 Крытынская Елена Николаевна часть 2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИОСЕНСОРНЫХ УСТРОЙСТВ. ТЕСТ-РЕАКЦИЯ БТЭ.
1 1 Ферментный электрод как датчик тест-реакции биологического элемента. Поколения биосенсоров Общая схема работы биосенсора. Подходы к классификации биосенсоров Области применения биосенсоров. Основные направления применения биосенсоров в медицине Биосенсоры эколого-аналитического контроля Аналитические характеристики биосенсоров Преимущества биосенсоров по сравнению с традиционными методами анализа Тест-реакция. Тождественны ли понятия «тест-реакция» и «способ регистрации тест-реакции»? Понятие множественности тест-реакций Основные требования, предъявляемые к тест-реакции Принципы выбора тест-реакции. Факторы среды, влияющие на тест-реакцию
Электрический сигнал А g- электрод АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ (ОКСИДОСОДЕРЖАЩИЕ) 2 ФЕРМЕНТНЫЙ ЭЛЕКТРОД О 2
4 3 2 1 5 аналит (глюкоза) диффундирует через мембрану (БТЭ) из многокомпонентной смеси (анализата) распознание аналита БТЭ-ом и специфическая биохимическая реакция (тест-реакция) считывание и преобразование трансдьюсером информации, поступившей с БТЭ, в электрический (др. рода) сигнал СТАДИЯ сопряжения усиление электрического (др. рода) сигнала обработка сигнала и регистрация биохимической и электродной (либо прочей физико- химической) реакций 3
4
5
6
тип БТЭ, способ регистрации сигнала воспроизводимость действия природа генерируемого сигнала области потенциального применения тип компоновки специфичность действия 7
тип компоновки специфичность действия 8 СПЕЦИФИЧЕСКИЕ БИОСЕНСОРЫ, "узнают" одно соединение в смеси, высоко чувствительные БИОСЕНСОРЫ ГРУППОВОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ, узнающие в пробе целый набор веществ (тяжелые металлы, пестициды и т.д.). Биосенсоры на основе холинэстеразы служат для группового определения токсикантов ИСТИННЫЕ БИОСЕНСОРЫ – БТЭ и трансдьюсер связаны РЕАКТОРНОГО ТИПА – две компоненты разделены УПРАЩЕННОГО ТИПА – узлов транспорта и смешивания нет
тип БТЭ 9 способ регистрации сигнала БИОАФФИННЫЕ И ФЕРМЕНТ-КАТАЛИТИЧЕСКИЕ. ФЕРМЕНТНЫЕ, МИКРОБНЫЕ, ИММУНОСЕНСОРЫ, ДНК-СЕНСОРЫ, АПТАСЕНСОРЫ (малые РНК-), ТКАНЕВЫЕ, БИОСЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР. ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИЕ (амперометрические, потенциометрические, кондуктометрические и т.д.); ОПТРОДЫ (колориметрический, нефелометрический, флуоресцентный и т.д.); ГРАВИМЕТРИЧЕСКИЕ (акустический, пьезоакустический, основанный на поверхностном плазмонном резонансе и т.д.); ФИЗИЧЕСКИЕ (термометрический).
области потенциального применения 10 ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ЗДРАВОХРАНЕНИЕ ЭКОЛОГИЯ, МОНИТОРИНГ ОКРУЖ. СРЕДЫ БИОТЕХНОЛОГИЯ И Т,Д, природа генерируемого сигнала КИНЕТИЧЕСКИЕ биосенсоры - биосенсоры в которых аналит меняет свою природу и измеряемый сигнал служит мерой скорости реакции, СТАЦИОНАРНЫЕ (равновесные) -- это биосенсоры, у которых аналит не меняет своей природы и измеряемый сигнал определяется равновесием взаимодействия
Биосенсоры, способные быстро и воспроизводимо восстанавливаться, называют многоразовыми. С помощью таких устройств осуществляют прямой мониторинг увеличения или уменьшения концентрации определяемого вещества. Биосенсоры, которые не могут быть воспроизводимо и быстро восстановлены, т.е. теряют свои функциональные свойства должны называться одноразовыми, к их числу относятся биотесты и биоиндикаторы. 11
ОБЛАСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БИОСЕНСОРОВ МЕДИЦИНА КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА (методы распознавания болезней) ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ЭКОЛОГИЯ, МОНИТОРИНГ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ БИОТЕХНОЛОГИЯ ПИЩЕВАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ ВОЕННАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ 12
Иммуноанализ, диагностика аутоиммунных заболеваний с использованием иммуносенсоров; Мониторинг и диагностика онкологических заболеваний на ранней стадии; Мониторинг внутриутробных генетических аномалий у плода в период беременности; ДНК-диагностика (ДНК-сенсоры); Контроль появления опасных метаболитов в ходе хирургической операции. 13
Непрерывный или периодический скрининг жидких сред организма (мониторинг ионов, кислорода, углекислого газа, глюкозы, холестерина, рН); Автоматизированный анализ содержания метаболитов, лекарств, гормонов в биологических жидкостях человека, контроль совместного введения лекарственных препаратов; Неинвазивный (без отбора крови) клинический анализ. Пример: анаэробное состояние мышц, подагра, мочекаменная болезнь, болезнь почек, патологии печени. 14
15 капиллярный поток Принцип работы иммунохроматографического экспресс-теста ПРИМЕР ПРАКТИЧЕСКОЙ РЕАЛИЗАЦИИ
Биосенсор в виде эластичного клейкого пластыря ( SWEAT SENSOR) 16
Идентификация биологического материала по первичной последовательности нуклеотидов; Совершенствование методов ранней диагностики и лечения онкологических заболеваний (скрининг противоопухолевых препаратов, их ранняя диагностика по специфическим биохимическим маркерам); Определение фармакологических препаратов противоракового действия; Выявление ДНК повреждающих факторов, включая действие мутагенных факторов, ионизирующего излучения. 17
Прямое определение факта комплексообразования по изменению массы ДНК, сорбированной на поверхности масс-чувствительного сенсора – пьезоэлемента. Обнаружение специфических изменений ДНК по электрическим, оптическим или иным характеристикам самой нуклеотидной последовательности. Включение в состав олигонуклеотидов меток, обнаруживаемых электрохимическими или оптическими детекторами. Это могут быть электрохимически активные группировки, ферменты, флуорогенные заместители, ковалентно связанные с олигонуклеотидными последовательностями. 18
Схема ДНК-сенсора на основе УНТ ДНК УНТ ДНК 19
непрерывный мониторинг качества воды; экспресс оценка загрязнения атмосферного воздуха токсичными веществами (сероводородом, ароматическими углеводородами, окислами азота, металлорганическими соединениями); контроль остаточных (малых) количеств пестицидов в воде, почве, продуктах питания и объектах окружающей среды; 20
экспресс-определение биохимического потребления кислорода (БПК) в сточных водах пищевых и биотехнологических производств (БПК-сенсоры); детекция фенолов и его производных; определение супертоксинов и боевых отравляющих веществ; определение ионов тяжелых металлов (ртуть, мышьяк, кадмий, цианид); детекция нефти. 21
ФЕРМЕНТ АНАЛИТ цитохром с оксидаза цианиды, сероводород, атразин тирозиназа фосфороорганические, тио- и дитиокарбаминатные пестициды, хлорфенолы, тиомочевина, гидрозин и его метилпроизводные пероксидаза цианиды, фториды, сульфиды, тиомочевина и ее производные, метилизоцианад, фенолы, ртуть ( II) и ртутьорганические соединения алкогольдегидрогеназа цианиды, ртуть ( II) кислая фосфатаза фториды, фосфорорганические пестициды щелочная фосфатаза фосфорорганические и карбаминатные пестициды уреаза ионы тяжелых металлов холинэстераза фосфорорганические и карбаминатные пестициды ФЕРМЕНТЫ В СОСТАВЕ ЭКОЛОГО-АНАЛИТИЧЕСКИХ СЕНСОРОВ 22
А - Схема прибора в собранном состоянии; В - Фотография устройства; С – Фотография прибора в собранном состоянии. Биотин добавлен в буферный раствор для измерения сопротивления Хеморезистивный биосенсор 23
Контроль качества продуктов питания по основным биомаркерам (крахмал, сахара, этиловый спирт). Понятие биокода для идентификации продуктов питания. Проблема ГМО. Определение витаминов, антиоксидантной емкости с помощью биосенсоров на основе ксантиноксидазы и ДНК-сенсоров. Оценка общего содержания утилизируемых сахаров в сбраживаемом сусле Использования биосенсоров для решения специальных задач: старение продуктов питания, оценка возраста вина и крепких спиртных напитков, фальсификация продуктов питания. 24
Определение продуктов биотехнологии (пенициллин, этанол, крахмал) Оценка качества продуктов питания (контрафактная продукция, наличие пищевых добавок, антибиотиков) Контроль биотехнологических процессов Оценка влияния производства на окружающую среду и население. 25
26 КАЛИБРОВОЧНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СВОЙСТВА АНАЛИТИЧЕСКОГО СИГНАЛА ( величина отклика, время стационарного отклика, время мгновенного отклика) ДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ( время подготовки к работе, быстродействие, время жизни или срок службы) ОБРАТИМОСТЬ СИСТЕМЫ СТАБИЛЬНОСТЬ СЕЛЕКТИВНОСТЬ ТОЧНОСТЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ БАЗОВЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
27 Калибровочные характеристики: Градуировочный (калибровочный) график ; Чувствительность (А/М∙см 2 ) - тангенс угла наклона линейного участка градуировочного графика биосенсора в линейных координатах, зависит от количества иммобилизованного БТЭ; Удельная чувствительность (А/М∙см 2 мг) - величина чувствительности биосенсора, приходящаяся на 1 мг иммобилизованного БТЭ; Нижний предел обнаружения (нг/л, моль) - наименьшая определяемая концентрация аналита, при которой отклик в 3 раза выше нулевой концентрации; Верхний предел обнаружения; Рабочий и линейный диапазон концентраций. БАЗОВЫЕ АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
ИОНИЗИРУЮЩЕЕ ИЗЛУЧЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЯ ФОНОВОГО ЭЛЕКТРОЛИТА ДЕТЕРГЕНТЫ, ОРГАНИЧЕСКИЕ РАСТВОРИТЕЛИ 28
29 высокая специфичность и чувствительность; малогабаритность, точность, устойчивость; высокая помехозащищенность, т.е. не чувствительность к электромагнитным полям, радиационным полям; относительно низкая стоимость; отсутствие требований к высокой квалификации персонала; удобство применения интегральной технологии;
30 возможность анализа малых объемов образцов в сочетании с оперативностью; возможность выявления не только известных, но и ранее не использованных веществ; возможность длительной эксплуатации в режиме непрерывной работы; возможность контроля за результатами анализа по типу обратной связи, что достигается за счет совместимости биосенсоров с микропроцессором.
« Тест-реакция » («тест-процесс») – биохимическая реакция (биокаталитического, или биоафинного типа), которая позволяет качественно или количественно оценить процесс взаимодействия БТЭ с аналитом (или оценить состояние БТЭ после воздействия аналита). E + S ⇔ES →E + P, E + S ⇔ES 31
биосенсоры тест-реакции ДНК-сенсоры поляризация света оптически активным веществом ДНК; поглощение излучения в ультрафиолетовой области за счет азотистых оснований ДНК; поглощение излучения в других областях спектра при взаимодействии с различными химическими веществами, при этом поглощение будет пропорционально концентрации вещества; комплементарность, т. е. объединение цепей нуклеотидов ДНК; удлинение и укорочение цепи ДНК при воздействии некоторых ферментов мутагенных веществ; образование множеством молекул ДНК структуры жидкого кристалла Иммуносенсоры – регистрирующие специфическое взаимодействие антиген/антитело образование крупных клеточных агрегатов, если антиген расположен на поверхности клеток (антитела «склеивают» клетки, и они оседают на дно); образование отчетливых линий в густеющем геле с клетками-антигенами после того, как туда добавляют антитела за счет возникновения клеточных агрегатов; увеличение силы тяжести, действующей на поверхность, если на ней иммобилизованы антитела, а клетки с антигенами находятся в питательной среде (образование комплекса приводит к выпадению осадка), что используется в гравиметрических датчиках; изменение электрических свойств (емкости) антигена и антитела при образовании комплекса, суммарная емкость которого уменьшается за счет последовательного соединения емкостей исходных биообъектов; изменение оптических и электрических характеристик приповерхностного слоя электрических проводников при осаждении на них комплекса. Биосенсоры на основе органелл (пигментов) поглощение; поглощение и рассеяние света; флуоресценция 32
Для одного и того же БТЭ, для одного и того же аналита (одной и той же тест-системы) могут быть выбраны совершенно различные тест-реакции: МНОЖЕСТВЕННОСТЬ ТЕСТ-РЕАКЦИЙ БТЭ 33
1. Реакция должна быть легко наблюдаемой, надежно и однозначно фиксироваться трансдьюсером. 2. Реакция должна быть однозначно связана с концентрацией измеряемого аналита. 3. Реакция должна фиксироваться наиболее дешевым и простым трансдьюсером. Регистрация тест-реакции должна удовлетворять ряду специальных требований, определяемых конкретными условиями использования биосенсора. Субстрат, либо продукт биокаталитической реакции должен быть электрохимически (оптически…) активен, то есть способен быстро и желательно обратимо окисляться или восстанавливаться на электроде при наложении на него соответствующего потенциала. ОСНОВНЫЕ ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К ТЕСТ-РЕАКЦИИ Можно ли утверждать, что для вполне определённого биологического тестирующего элемента, предназначенного для определения концентрация вполне определённого вещества, существует лишь одна тест-реакция? Нет, нельзя. 34
«тест-реакция» = «способ регистрации тест-реакции» Каждая из тест-реакций может быть зарегистрирована совершенно различными способами, разные типы трансдьюсеров могут быть использованы. Например, процесс образования аммиака 35
Первая группа объединяет факторы исследуемого образца. К ним, например, относятся токсические вещества, которые содержатся в исследуемом объекте. Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и "шумовые" помехи. Это могут быть изменения температуры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы. Данные факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимизации их воздействия. Третья группа факторов - разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно, с целью регулирования ее чувствительности. 36
поглощение излучения веществом (колориметрические и спектрофотометрические методы); рассеяние излучения веществом (нефелометрические методы); люминесценция вещества (спектрофлуоресцентные, хемо- и биолюминесцентные методы). На основе указанных явлений и базируются различные конструкции биосенсоров. ОСНОВНЫЕ ЯВЛЕНИЯ, РЕГИСТРИРУЕМЫЕ ОПТИЧЕСКИМИ ДАТЧИКАМИ 37
Перечислите основные аналитические характеристики биосенсоров. Тождественны ли понятия тест-реакция и способ регистрации сигнала? Почему? Назовите преимущества применения биосенсоров 37
СПАСИБО!
