КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ МЕТОДОМ ПЦР
Лаборатории, использующие в своей работе метод ПЦР, должны осуществлять следующие виды контроля: Производственный Внутрилабораторный Внешний контроль работы лаборатории
Требования к помещениям ПЦР-лаборатории ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон: - приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала; - выделения НК; - приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР; детекции продуктов амплификации методом электрофореза. Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами ).
Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями. Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами в соответствии с методическими указаниями по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях. Бактерицидные лампы в помещениях ПЦР-лаборатории устанавливают из расчета 2,5 Вт/куб. м.
Для проведения исследования используют приборы и расходные материалы, исключающие возможность перекрестной контаминации исходного материала, выделенных НК и продуктов ПЦР. Для этого используют: - термостаты с твердотельным термоблоком ; - пробирки с плотно закрывающимися крышками; - одноразовые пробирки и наконечники к микродозаторам ; наконечники, строго соответствующие автоматическим пипеткам, а пробирки для амплификации - термоциклерам, смена наконечников после завершения каждой манипуляции является обязательной ; специальные контейнеры для сброса использованных наконечников и пробирок, устанавливаемые на рабочих местах.
После проведения детекции и учета результатов исследования пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к микродозаторам подвергают первичной обработке дезинфицирующими растворами, вызывающими деградацию ДНК (например, 0,2%- ный раствор ДП-2Т ). Процедуру проводят непосредственно в комнате учета результатов амплификации. Окончательную дезактивацию использованных расходных материалов и реагентов (гель, буфер для электрофореза) производят в автоклавной комнате.
Сотрудников каждой рабочей зоны обеспечивают спецодеждой: медицинским халатом, шапочкой, перчатками и сменной обувью. При работе в помещении детекции продуктов амплификации следует надевать бахилы. Перемещение одежды из зоны в зону категорически не допускается. Рекомендуется использование одноразовой одежды. Обработку рабочей одежды из зоны детекции продуктов амплификации проводят отдельно от одежды из других зон.
При возникновении контаминации лаборатории проводят следующие мероприятия : - утилизацию всех находящихся в "контаминированной" зоне реактивов ; - утилизацию исследуемых материалов на всех промежуточных стадиях обработки (кроме исходной); - генеральную уборку, химическую и ультрафиолетовую дезинфекцию всех поверхностей лабораторных помещений; - дезинфекцию мебели, рабочих поверхностей, а также поверхностей корпусов приборов и оборудования химическим методом и ультрафиолетовым излучением ; - обработку паром под давлением всей спецодежды " контаминированной" зоны. Случаи контаминации регистрируют в специальном журнале с указанием мероприятий по ее устранению и результатов внутрилабораторного контроля. Проведение ПЦР-исследований до завершения деконтаминационных мероприятий не допускается.
Внешний контроль работы лаборатории Согласно Методическими указаниями (МУ1.3.2569-09) «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности», лаборатория должна осуществлять следующие виды контроля: Лаборатория должна принимать участие, в установленном порядке, в мероприятиях (программах) по внешней оценке качества лабораторных исследований (ФСВОК и т.д.) по конкретным нозологическим формам не реже 1 раза в год.
Основными разделами ФСВОК относительно ПЦР являются : ПЦР – выявление микобактерий туберкулеза Молекулярно-генетическое выявление лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза ПЦР – выявление вируса гепатита В ( HBV) ПЦР – выявление HCV ПЦР – выявление ВИЧ ПЦР – выявление C. trachomatis, M. hominis, U.urealiticum ПЦР – выявление N.gonorrhoeae ПЦР – выявление вируса папилломы человека (ВПЧ ) Количественное определение ДНК вируса гепатита В (ВГВ) методом ПЦР Количественное определение РНК вируса гепатита с ( HCV) методом ПЦР
Внутренний контроль качества Порядок проведения внутрилабораторного контроля качества определяется в МУ1.3.2569-09 следующими мероприятиями : В лаборатории, использующей методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) в диагностических целях, проводят внутрилабораторный контроль качества проводимых исследований с периодичностью, зависящей от объема выполняемой работы и определяемой руководителем лаборатории, но не реже одного раза в квартал. При проведении внутрилабораторного контроля качества лабораторных исследований могут использоваться аттестованные на наличие аналита (его количества) панели производителей коммерческих наборов или внутрилабораторные аттестованные образцы, содержащие и не содержащие нуклеиновые кислоты конкретных возбудителей в различной концентрации, стабильные в условиях хранения.
Реализация указанных положений возможна при использовании следующих подходов : 1. Постановка внутренних контролей (ВК) 2. Использование отрицательных контрольных образцов (К-) 3. Использование положительных контрольных образцов (К+) 4. Постановка специальных контролей 5. Регулярные смывы с поверхностей
Внутренние контроли Препарат ДНК, подготовленный к ПЦР из биологического материала, может содержать примеси ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых случаях и приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым контролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью. Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так называемый, внутренний контроль. Представляет собой любой препарат ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных тест-систем иногда используют, например, β- глобиновый ген, к концам которого с помощью генно-инженерных манипуляций «пришивают» участки ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. При отсутствии регистрации внутреннего контроля и выявления специфической ДНК результат следует считать недостоверным. В этом случае для данного исследуемого образца рекомендуется перевыделить ДНК.
Положительный контроль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига праймеров, например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специфические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по размеру от ампликонов, образующихся в результате амплификации с контрольным препаратом ДНК. Отрицательный контроль включает в себя все компоненты реакции, но вместо клинического материала или препарата ДНК вносится соответствующее количество деионизованной воды или экстракта, не содержащего исследуемой ДНК. Отрицательный контроль необходим для проверки компонентов реакции на отсутствие в них ДНК или клеток возбудителя вследствие контаминации и исключения учета ложноположительных результатов.
К специальным контролям можно отнести следующее : Маркеры длин фрагментов ДНК Контроль фона Стандарты и калибраторы Контроль взятия материала (КВМ)
Маркеры длин фрагментов ДНК используются при детекции результатов ПЦР методом гель-электрофореза. Стандарты (маркеры) представляют собой фрагменты двуцепочечной ДНК строго определенной длины, позволяющие идентифицировать и охарактеризовать полосы, полученные в геле, и оценить результаты анализа с точки зрения их специфичности.
Контроль взятия материала – ключевой момент в определении качества взятой для исследования пробы. Данный подход позволяет исключить ошибки преаналитического этапа при исследовании биологического материала, содержащего клетки человека, и избежать получения недостоверных, ложноположительных или ложноотрицательных результатов ПЦР. Кроме того, он может быть использован для оценки количества геномной ДНК человека.
