профессор Бажукова Т.А. зав.каф. микробиологии, вирусологии и иммунологии
Иммунные реакции Иммунные реакции – это взаимодействие между Аг и Ат, реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью. Использование ИР : Определение Ат в сыворотке больного (серодиагностика). Определение Аг (серотипирование – идентификация возбудителя; обнаружение Аг в биологических жидкостях).
Корпускулярные или клеточные Растворимые или гаптены Молекулярные (вирусы, экстракты )
I фаза специфическая – образование комплекса Аг+ Ат Условия: специфичность эпитопа (валентность) и паратопа (авидность и аффинность). Аффинность – сила специфического взаимодействия Ат с Аг (энергия их связи). Определяется степенью стерического (пространственного) соответствия эпитопа и паратопа. Чем > связей, тем устойчивее и продолжительнее жизнь Аг+Ат. Наиболее аффинными являются нормальные Ат. Авидность – прочность связывания Аг и Ат. Определяется количеством паратопов у Ат ( IgM).
II фаза неспецифическая – видимые физические явления (выпадение в осадок, помутнение и т.д.) Условия: солевой состав (электролиты), рН среды, осмотическая плотность, температура среды.
Реакция Аг+Ат
Реакция Аг+Ат Схема комплекса антиген — антитело. А — зона избытка антигена; Б — точка эквивалентности; В — зона избытка антител
АГ+АТ
Реакция Аг+Ат
Реакции агглютинации Реакции преципитации Реакции с участием комплемента (РСК) Реакции с использованием меченых компонентов (РИФ, ИФА, РИА)
Реакция агглютинации
Линейная или объемная РА на стекле РПГА РТГА Реакция Кумбса Использование: Определение титра антител Определение возбудителя (антигена) иммунологическая идентификация Определение групп крови
РПГА
РПГА
Латекс-агглютинация
Латекс-агглютинация
Антительные эритроцитарные диагностикумы (определение антигена) Для определения: токсинов (ботулинический и др.) гормонов (гонадотропный при беременности и др) повышенной чувствительности к лекарственным препаратам
Определение возбудителя с помощью стафилококков, обработанных иммунной диагностической сывороткой (сродство белка А стафилококка и Fc – фрагментов иммуноглобулинов, которые взаимодействуют с возбудителем (антигеном). Образование хлопьев.
РА для определения групп крови РА для определения резус-фактора РА для определения антирезусных антител ( непрямая реакция Кумбса)- для определения неполных Ат.
Р кольцепреципитации Р двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (преципитации в агаре) Осадочные РП Р радиальной иммунодиффузии (реакция Манчини) Р иммуноэлектрофореза Р флоккуляции (по Рамону)
Реакция преципитации
РП по Оухтерлони
РП в агаре
РП в агаре
Сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации. Смесь антигенов вносят в лунки геля и разделяют с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят сыворотку и в месте «встречи» с антигеном образуются линии преципитата.
Реакция флоккуляции (по Рамону) Для определения активности антитоксической сыворотки и анатоксина. Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия вирусов обработанных антителами (иммунными сыворотками) – микропреципитаты («венчик» из антител контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптическими прпаратами)
Реакция лизиса Реакция связывания комплемента Реакция радиального гемолиза Реакция иммунного прилипания
РН токсина антитоксином РН на культуре клеток
Виды иммунных реакций
Р иммунофлюоресценции (РИФ, реакция Кунса) – прямая и непрямая Иммуноферментный анализ (ИФА) Иммуноблотинг (сочетание электрофореза и ИФА) Р радиоиммунного анализа (РИА) Иммунная электронная микроскопия – микроскопия в электронном микроскопе вирусов предварительно обработанных иммунной сывороткой меченой электроннооптически плотными препаратами (ферритин).
Реакция иммунофлюоресценции
Иммунные реакции с мечеными Аг и Ат
ИФА
Иммунохроматография Рис. 1. Принцип работы иммунохроматографического экспресс-теста. 1 – образец, содержащий аналит; 2 – конъюгат; 3,4 – иммобилизованные антитела (тестовая и контрольная полосы); 5 – подушечка для образца; 6 – подушечка для конъюгата; 7 – мембрана; 8 – подушечка для абсорбции реагентов; 9 – подложка для мембраны; 10 – тестовая полоса: положительный результат; 11 – контрольная полоса: достоверный результат теста.
Иммунохроматография Исследуемый образец суспендируют в специальном буферном растворе. Надосадочная жидкость смешивается в определенной пропорции с конъюгатом – специфичными антителами, связанными с окрашенными частицами латекса. Частицы комплекса «антиген–конъюгат» двигаются вдоль нитроцеллюлозной мембраны, в которой иммобилизованы антитела, специфичные к антигену. Они связывают частицы движущегося комплекса, в тестовой зоне образуется видимая полоса, свидетельствующая о наличии определяемого возбудителя в образце. Контрольная полоса, свидетельствующая о том, что миграция образца вдоль мембраны произошла нормально. В результате анализа появляются полосы разного цвета, соответствующих присутствующему в образце возбудителю.
Иммунохроматография Положительный результат экспресс-теста RIDA Quick Verotoxin / О157 Combi Формат теста: вверху – тест-кассета, внизу – тест-полоска. 1 – участок внесения образца. 2 – участок расположения конъюгата. 3 – реакционная зона; слева направо – контрольная полоса (С); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии в образце веротоксина (T2); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии антигенов штамма O157 (T1). 4 – участок абсорбции реагентов (закрыт пленкой с названием теста).
РИА (радиоиммунный анализ)
Иммуноблотинг Блоттинг – ( Blot – пятно) основан на сочетании электрофореза и ИФА или РИА Антиген выделяют с помощью ЭФ в геле Переносят на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. ( коммерческие)
На полоски наносят сыворотку больного Отмывают Наносят антисывортку меченую ферментом Добавляют хромоген Изменение окраски Возможна радиография если добавляли сыворотку меченую радиоактивной меткой
Иммуноблотинг
Проточная цитометрия и сортировка – это современная технология быстрого измерения параметров клеток или клеточных компонентов, основанная на пропускании суспензии микрообъектов через зону чувствительности прибора с возможностью их последующего разделения на основе измеренных характеристик. Использование моноклональных Ат к CD -антигенам.
Фенотипирование клеток с применением моноклональных антител Изучение пролиферативной активности нормальных и опухолевых клеток на основе анализа клеточного цикла Выявление анеуплоидных клонов и апоптозных клеток Автоматический счет форменных элементов крови Исследование размеров клеток Дифференциальный анализ с подсчетом формулы крови Выделение атипичных клеток
Высокая скорость анализа Большая точность и воспроизводимость измерений Надежность и достоверность результатов Анализ точности измерений, сто дает возможность «контроля качества» Большая разрешающая способность и чувствительность метода Способность определять и анализировать ничтожно малые концентрации частиц (при тромбоцитопениях) Применение при анализе компьютерной техники при регистрации, накоплении и хранении данных
Высокая стоимость аппаратуры для проточной цитометрии Дороговизна обучения технического персонала Отсутствие прямого визуального анализа объектов и изучения тонкой структуры клеток по сравнению с компьютерной цитофотоморфометрией фиксированных препаратов
Подсчет и анализ клеточных элементов, редко встречающихся в популяции (стволовых клеток) Исследование распределения клеток по стадиям клеточного цикла Изучение анеуплоидных клеток, особенно в случаях, когда это затруднительно при помощи кариологического анализа (низкий уровень пролиферации или клетки находятся в стадии G 0 ) Количественная оценка экспрессии антигена Выявление клеток по наличию 2,3 и более иммунологических маркеров Прижизненный анализ и сортировка клеток Быстрый анализ динамики протекания клеточных процессов в гетерогенных популяциях Возможность препаративной сортировки, в том числе стерильной, для последующей работы с живыми клетками
Быстрое пропускание суспензии клеток через зону чувствительности прибора (до 30м/с с регистрацией 1000 кл/с) Гистограмма составляется (установление шкалы интенсивности по оси абсцисс по оси ординат –число клеток с данным значением измеряемого параметра) При измерении 2-х параметров данные представляются в виде графика в двухмерной системе координат.
Измерение клеток - методы Кондуктометрия – капилляр диаметром 70 мкм и длиной 0,75 диаметра, с большой скоростью пропускается суспензия клеток. По обе стороны от капилляра –электроды, между которыми постоянный ток. Электрическое сопротивление клетки выше чем электролита Радиочастотный анализ ( RF –radio frequency) разновидность кондуктометрического метода на гематологических анализаторах
Измерение клеток - методы Регистрация светорассеяния и поглощения. Светорассеяние обусловлено клеточным размером, формой, плотностью, окрашиванием и гранулярностью внутриклеточных структур. Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и рассеивающих компонентов.
Измерение клеток - методы Флуориметрия - измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами. Регистрация флуоресценции имеет преимущества: Флуоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам Концентрация красителя для исследования клетки очень низкая, что минимально сказывается на жизнеспособности объекта Нефлуоресцирующие соединения могут становиться флуоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами
Многоцветный анализ – одновременное использование нескольких флуоресцентных меток разного цвета. Преимущества: Экономия времени, расходных материалов и исследуемых клеток Повышение чувствительности и информативности анализа Снижение цены реактивов
Изучение поляризации флуоресценции позволяет охарактеризовать вязкость или текучесть мембран, которое отражает функциональное состояние клетки. При поляризации лазерного излучения флуоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет.
Измерение клеток - методы Анализ сигнала волновой формы (анализ формы сигнала) можно использовать для измерения ядерного и цитоплазматического диаметра. Применяется «щелевой анализ» - лазерный луч фокусируют до 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью.
Измерение клеток - методы Сортировка клеток служит для клонирования клеток а также для получения чистых суспензий клеток для последующего анализа при помощи других методов (морфологических, электронно-микроскопических, генно-инженерных и др.).
Иммуномагнитная сепарация клеток Негативное и позитивное выделение Т-, В-, NK – клеток и моноцитов Выделение С D 34 c тволовых клеток Системы снятия частиц/антител с выделенных клеток Чистота выделенных фракций до 99% при выходе целевых клеток >95% Выделение клеточных популяций из цельной крови, костного мозга, других биологических жидкостей Сохранение жизнеспособности и функциональных свойств клеток Выделение HL А-клеток для серологического типирования (класс I, класс II) Выделение миелоидных ( CD 15), эндотелиальных ( CD 30), пролиферирующих ( CD 71) клеток
