Понятие о генной инжен é рии, история развития. Основные направления и задачи генной инженерии на современном этапе. Получение генов. Химический и ферментативный синтез. Выделение генов с помощью ферментов рестрикции и трансдуцирующих фагов. Рестриктазы и их значение. Рекомбинантная ДНК. Векторы и их использование для переноса генетического материала. Метод электрофорезного анализа ДНК в агаровом геле Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее применение в практике. Секвенирование ДНК.
Генетическая инж é нерия – это конструирование функционально активных генетических структур (рекомбинантных ДНК) и наследственно измененных организмов. Датой возникновения генной инженерии считается 1972 год
Области применения генной инженерии на современном этапе: получение генноинженерных вакцин; получение искусственных белков с заданными свойствами; получение гормонов, ферментов; диагностика и лечение заболеваний. Способы получения генов: выделение генов из ДНК; химико-ферментативный синтез; ферментативный синтез.
Сельское хозяйство Микробиологическая промышленность Фармакологическая промышленность Пищевая промышленность
Рестриктирующие эндонуклеазы ( рестриктазы ) – это ферменты, способные разрезать молекулу ДНК в строго определенных местах с образованием липких концов. Рестриктазы были открыты в 1968 году.
Eco RI фермент эндонуклеазы ( фермент, гидролизующий внутренние фосфо-диэфирные связи и расщепляющий молекулы ДНК и РНК ) рестрикции, выделенный из вида Е. coli. Это фермент рестрикции, который расщепляет двойные спирали ДНК на фрагменты в определенных местах, а также является частью системы модификации рестрикции. Eco часть названия фермента происходит от вида, из которого он был выделен - "E" обозначает общее название, которое является " Escherichia ", а " co " обозначает видовое название, " coli ", в то время как R представляет конкретный штамм, в данном случае RY13, а I обозначает, что он был первым ферментом, выделенным из этого штамма.
-- Г ААТТ Ц -- -- Ц ТТАА Г --
Вектор – это молекулы ДНК, которые способны переносить чужеродные гены и обеспечивать их репликацию в клетке – хозяине. Типы векторов: 1) векторы для клонирования; 2) экспрессионные векторы; 3) векторы для трансформации.
иметь свойство репликации; содержать сайты рестрикции, т.е. участки узнавания для рестриктаз. При этом места разрезания и введения другой ДНК не должны влиять на репликацию вектора ; иметь один или несколько маркирующих генов, по которым его можно обнаружить ; содержать специфические для данной клетки промоторы и терминаторы транскрипции.
трансформация ( изменение генетического состава клеток путем привнесения извне чужеродного генетического материала, перенос чужеродных (природных или искусственно созданных) донорских генов в клетки-реципиенты растений, животных и микроорганизмов, и получение таким образом трансгенных организмов с новыми или усиленными свойствами и признаками ); трансфекция ( процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот невирусным методом ); трансдукция ( процесс переноса ДНК между клетками при помощи вирусов. Примером трансдукции является перенос бактериальной ДНК из одной клетки в другую бактериофагом. )
Принцип метода: 1) ДНК обрабатывают рестриктазами и помещают в лунки застывшего агарового геля, который затем помещается в камеру для электрофореза. 2) под действием электрического поля фрагменты ДНК начинают перемещаться в геле, скорость их перемещения зависит от длины фрагмента. Короткие фрагменты движутся быстрее, при этом цепочки ДНК различной длины отделяются друг от друга, но не повреждаются. 3) после электрофореза гель окрашивают красителем этидиум бромидом, который связывается с ДНК. 4) гель помещают под ультрафиолетовый свет и на нем хорошо видны окрашенные в красный цвет светящиеся фракции ДНК. В результате электрофорез позволяет разделить, а затем извлечь любые фрагменты ДНК в чистом виде.
Форез Амплификация
Электрофореграммы
Полимеразно -цепная реакция протекает в 3 стадии: Денатурация. Смесь, в которой содержится ДНК, нагревают до t 90-95 ° С. В течение 15 секунд происходит разрушение слабых водородных связей между нитями ДНК и образуется 2 одноцепочечных ДНК из одной двухцепочечной. Гибридизация праймеров. Температуру снижают до 50 °С. При этом происходит гибридизация цепей ДНК с праймерами в течение 30 секунд. Полимеризация. Смесь с ДНК нагревают до температуры 70 °С. При этом Tag - полимераза удлиняет оба праймера с их 3`-концов. Праймеры дорастают до размеров матрицы. Процесс протекает 90 секунд и в результате количество ДНК удваивается. Фермент Tag -полимераза был выделен из термофильных бактерий и отличается устойчивостью к высоким температурам. За 20 циклов амплификации количество копий ДНК возрастает в 106 раз. ПЦР- реакция происходит в специальном приборе- амплификаторе.
Секвенирование — это определение последовательности нуклеотидов в фрагменте ДНК. В результате секвенирования определяется также аминокислотная последовательность белка в соответствии с нуклеотидной последовательностью в соответствующем гене.
Секвенирование нуклеиновых кислот (другими словами, определение их нуклеотидной последовательности) — это расшифровка первичной структуры линейных молекул ДНК или РНК, состоящих из последовательности «букв» — нуклеозидтрифосфатов : дАТФ ( дезоксиадениновая к-та), дГТФ, дЦТФ, дТТФ. и УТФ. Эти «буквы» зачастую именуют просто по азотистому основанию, входящему в их состав — аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), тимин (Т), а также урацил (У) в случае РНК.
Метод «терминаторов»: используют ДНК-полимеразу, олигонуклеотидные праймеры и смесь четырех дезоксинуклеотидов ( dNTPs ) (А, Т, G и C), один из которых радиоактивно помечен по α-положению фосфата ( 32 P). В каждую из четырех реакций добавляется по одному 2’, 3’ - дидезоксинуклеозидтрифосфату ( ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP ), которые терминируют дальнейшую реакцию (синтез комплементарной молекулы ДНК с матрицы) — таким образом в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом. Затем полученные фрагменты визуализируют с помощью электрофореза и, сравнивая длины фрагментов из четырех реакций с ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP, восстанавливают последовательность ДНК.
Секвенирование по Сэнгеру позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар нуклеотидов и применяется для небольших фрагментов генома/генов. В частности, оно используется для : секвенирования отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов; идентификации вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных); валидации данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS); микросателлитного анализа; анализа делеций и инсерций (малых и протяженных).
АННОТАЦИЯ ГЕНОМА – маркировка генов и других объектов внутри них. ГЕНОМ - наследственный материал, заключенный в клетке организма и необходимый для построения и поддержания его жизнедеятельности. Раздел молекулярной генетики, занимающийся геномом и генами организмов, принято называть геномикой. ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, макромолекула, обеспечивающая хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы у многих организмов. ДНК-БИБЛИОТЕКА (ГЕНОМНАЯ БИБЛИОТЕКА ) - набор ДНК-фрагментов всего генома организма. Эти ДНК-фрагменты фланкированы идентичными ДНК-адаптерами и содержат различные вставки генома. ДНК-АДАПТЕРЫ - небольшие фрагменты ДНК известной последовательности, фланкирующие ДНК-библиотеку. Используются как участки, с которых начинается амплификация или секвенирование ДНК-библиотеки.
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК - своеобразная модификация молекулы ДНК путем присоединении метильной группы (-CH 3 ) к цитозину в составе CpG-динуклеотида. Один из способов регуляции работы генома без изменения нуклеотидной последовательности ДНК.НУКЛЕОТИДЫ (НУКЛЕОЗИДФОСФАТЫ ) - низкомолекулярные вещества (мономеры), составляющие сложные биологические полимеры: соответственно РНК или ДНК. Нуклеотиды, составляющие ДНК: аденин (A), тимин (T), гуанин (G) и цитозин (C). В РНК вместо тимина присутствует урацил (U ). ПЦР (ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ) - молекулярно-биологический метод, позволяющий добиться колоссального (до 10 12 раз) увеличения или амплификации числа копий определенного фрагмента ДНК. РНК - рибонуклеиновая кислота, макромолекула, образующаяся у многих организмов в результате считывания с ДНК (транскрипции), необходима в процессе синтеза белков, а также многочисленных регуляторных процессов в клетке. Также ответственна за хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы у некоторых вирусов.
РЕСЕКВЕНИРОВАНИЕ - повторное определение последовательности ДНК организма с уже расшифрованным геномом (применяется, например, при поиске вариантов, связанных с наследственными заболеваниями у человека). СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК ИЛИ РНК - определение первичной последовательности нуклеотидов в составе макромолекул, несущих наследственную информацию. СЕКВЕНИРОВАНИЕ DE NOVO - секвенирование нового для науки (ранее не прочитанного) генома. ЧТЕНИЯ (РИДЫ, READS ) - фрагменты ДНК (длиной от 25 до 20 000 нуклеотидов), считываемые с генома при помощи специальной машины — секвенатора. ЭМУЛЬСИОННАЯ ПЦР (ЭПЦР ) - ПЦР, проводимая в эмульсии, где в каждой капельке масла амплифицируется единичная молекула ДНК (фрагмент ДНК ). ЭПИГЕНОМИКА - один из разделов геномики, посвященный изучению изменения экспрессии генов, вызванного механизмами, не затрагивающими последовательности ДНК, например, через метилирование ДНК.
