Доклад подготовили студентки группы МЭ-12 Пустынская Алеся Стасенко Александра Москва 2021
Глутаминовая кислота — 2-аминопентандиовая или α-аминоглутаровая кислота. Название кислоты произошло от сырья, из которого она была впервые выделена – клейковина пшеницы. Глутаминовая кислота впервые была выделена из эндосперма пшеницы в 1866 г. Ритгаузеном была синтезирована в 1890 г. Вольфом. 2 Суточная потребность в глутаминовой кислоте выше, чем во всех других аминокислотах и составляет 16 грамм в сутки.
Молекулярная масса: 147.13 г/моль Плотность: 1,538 Температура плавления 205 ºC альфа 32 º (с = 10,2 н. HCl) Растворимость в воде 7,5 г / л (20 ºC). Очень плохо растворяется в холодной воде. Белый кристаллический порошок кислого вкуса. Глутаминовая кислота растворяется в разбавленных кислотах, щелочах и горячей воде, трудно растворяется в холодной воде и концентрированной соляной кислоте, практически не растворима в этиловом спирте, эфире и ацетоне. Для L-изомера температура плавления 247-249°С. По химическим свойствам глутаминовая кислота-типичная алифатическая α-аминокислота. 3
L-Глутаминовая кислота встречается во всех организмах в свободном виде (в плазме крови вместе с глутамином составляет около 1/3 всех свободных аминокислот) и в составе белков. Заменимая аминокислота. L-Глутаминовая кислота-предшественник в биосинтезе орнитина и проли-на, участвует в переаминировании при биосинтезе аминокислот, а также в транспорте ионов К+ в центр. нервной системе. Глутаминовая кислота стимулирует окислительно-восстановительные процессы в головном мозге. Глутамат и аспартат содержится в мозге в высоких концентрациях. Глутаминовая кислота нормализует обмен веществ, изменяя функциональное состояние нервной и эндокринной систем. Стимулирует передачу возбуждения в синапсах ЦНС, связывает и выводит аммиак. Находясь в центре азотистого обмена, глутаминовая кислота тесно связана с углеводным, энергетическим, жировым, минеральным и другими видами обмена веществ живого организма. Участвует в синтезе других аминокислот, АТФ, мочевины, способствует переносу и поддержанию необходимой концентрации K+ в мозге, повышает устойчивость организма к гипоксии, служит связующим звеном между обменом углеводов и нуклеиновых кислот, нормализует содержание показателей гликолиза в крови и тканях. 4
5
Глутаминовая кислота и глутамин применяются: В пищевой промышленности в качестве вкусовой приправы, придающей продуктам продуктам и концентратам «мясной» запах и вкус, а также как источник легко усвояемого азота; В качестве кормовой добавки сельскохозяйственных животных; В медицине (широко применяется, например, при лечении болезни Боткина, печеночной коме, циррозе печени, пневмонии у детей раннего возраста и др.). 6
Глутаминовая кислота (пищевая добавка E620) и её соли (глутамат натрия Е621, глутамат калия Е622, диглутамат кальция Е623, глутамат аммония Е624, глутамат магния Е625) используются как усилитель вкуса во многих пищевых продуктах. Еще с начала XX века на Востоке глутаминовая кислота используется как вкусовая добавка к пище и источника легко усвояемого азота. Широкая популярность глутаминовой кислоты как пищевой добавки связана с ее способностью улучшать вкус продуктов. Глутамат натрия усиливает вкус многих пищевых продуктов, а также способствует длительному сохранению вкусовых качеств консервированных продуктов. Это свойство позволяет его широко используют в консервной промышленности, особенно при консервировании овощей, рыбы, мясных продуктов. 7
Использование глутаминовой кислоты как кормовой добавки особенно эффективно на фоне малобелковой диеты и у растущих организмов, когда потребность в источниках азота возрастает. По видимому, под влиянием глутаминовой кислоты происходит более полное использование белковой пищи, чему способствует возрастание переваривающей силы желудочного сока. Под действием глутаминовой кислоты компенсируется дефицит азота и происходит нормализация питания. По эффекту обогащения пищи белковым азотом к глутаминовой кислоте близок ее амид – глутамин. Эффективность глутаминовой кислоты зависит от ее дозировки. Применение больших количеств глутаминовой кислоты оказывает токсическое действие на организм. Доза глутаминовой кислоты, вызывающая гибель половины подопытных животных (DL50) для мышей – 7-8 г/кг, для крыс – 14-18 г/кг. Напротив, в дозе 0,77 г/кг глутамат натрия оказывает положительное влияние на организм. Для достижения максимального прироста веса содержание глутаминовой кислоты в рационе должно быть 5,66%, и не менее 4%. 8
Глутаминовую кислоту широко используют в медицине. Глутаминовая кислота способствует снижению содержания аммиака в крови и тканях при различных заболеваниях. Она стимулирует окислительные процессы при гипоксических состояниях, поэтому успешно применяют при сердечнососудистой и легочной недостаточности, недостаточности мозгового кровообращения и как профилактическое средство асфиксии плода при патологических родах. Также глутаминовую кислоту используют при болезни Боткина, печеночной коме, циррозе печени. В клинической практике применение этой кислоты вызывает улучшение состояния больных при инсулиновой гипокгликемии, судорогах, астенических состояниях. 9 В детской практике глутаминовую кислоту применяют при задержке психического развития, церебральных параличах, болезни Дауна, полиолимите. Важной особенностью глутаминовой кислоты является ее защитное действие при различных отравлениях печени и почек, усиление фармакологического действия одних и ослабление токсичности других лекарственных средств. Глутаминовая кислота оказывает влияние на состояние нервных процессов, в связи с этим она широко применяется при лечении эпилепсии, психозов, при истощении, депрессии, олигофрении, черепно-мозговых травм новорожденных, нарушениях мозгового кровообращения, туберкулезном менингите, параличах, а также при заболеваниях мышц. Глутаминовая кислота используется в сочетании с глицином для больных с прогрессирующей мышечной дистрофией, миопатией.
Абсорбция высокая. Хорошо проникает через гистогематические барьеры (в т.ч. через ГЭБ), клеточные оболочки и мембраны субклеточных образований. Накапливается в мышечной и нервной тканях, печени и почках. Выводится почками - 4-7% в неизмененном виде. 10
У нас глутаминовую кислоту производят: Марбиофарм, Квадрат-С, Фармстандарт, Арикон (глутамат натрия для пищевых производств). По состоянию на 2010 год мировой объем производства глутамата натрия составлял около 3 млн. тонн. Производственные мощности были распределены следующим образом: около 93% производственных мощностей было сосредоточено в Азии с материковым Китаем, на который приходится 80% этих мощностей. На Вьетнам приходится 11,3% от номинальной мощности в Азии, на Японию – 6,5%, Индонезия – 2,2%. Оставшиеся 8% мощностей сосредоточены в Бразилии и Европе (Франция). Согласно статистике, доля производства глутамата натрия в Китае с 2002 по 2008 год возросла с 44% до 78%. Уровень концентрации увеличился на 34%. Однако уже в 2009 году объем производства здесь снизился. В то время как еще в 2002 году количество производителей в Китае составляло общей сложности 140, в 2009 году этот показатель сократился до 17 крупнейших производителей. Фактически на сегодняшний день 75% производства глютаминовой кислоты в Китае обеспечивают 10 крупнейших производителей, мощность которых составляет более 60 тыс. тонн. Мировой рынок глутамата натрия, как основного усилителя вкуса, ежегодно растет на порядка 3-4%. Крупнейшим игроком на мировом рынке выступает компания Ajinomoto, с долей на рынке порядка 30%. Компания представлена в 14 странах мира, 6 из которых находятся в Азиатско-Тихоокеанском регионе. В мировых масштабах российский рынок усилителей вкуса сложно назвать крупным и развитым, т.к. при мировом уровне потребления более 3 млн. тонн, в российской промышленности используется лишь порядка 10 тыс. тонн., или 0,3% в общем объеме. 11
Объём мирового экспорт товаров группы «Глутаминовая кислота и ее соли» в 2019 году превысил 1,36 млрд долларов (согласно отчётности 68 стран). Годом ранее этот показатель составил 1,08 млрд долларов (по данным 69 стран). Какие страны экспортировали «Глутаминовая кислота и ее соли» в 2019 году? Основными экспортёрами товаров этой группы в 2019 году были Китай - 50% мирового экспорт (693 млн долларов) Индонезия - 12,1% (165 млн) Бразилия - 10,9% (149 млн) Таиланд - 10,9% (149 млн) Вьетнам - 6,82% 12
13
14
15
Глутаминовая кислота продаётся в форме таблеток в аптеках по цене от ~27 рубля за 10 таблеток 250 мг. Как добавка для спортивного питания глутаминовая кислота продается в форме порошка от 120 рублей за 100 грамм. Цена на глутамат натрия оптом: около 100 рублей за килограмм. Рыночная стоимость L-глутамата составляет 1000 долларов США за тонну (данные за 2004 год), а объем рынка достигает 1,5 млрд долларов США. Основные производства расположены в странах азиатского региона. 16
Получение глутаминовой кислоты химическим методом из сепарационного щелока Основные процессы получения глутаминовой кислоты из щелока включают: сгущение щелока до 65° Брикс, его гидролиз и очистку гидролизата от примесей; выделение и очистку глутаминовой кислоты; превращение глутаминовой кислоты в глутамат натрия и упаковку готового продукта. Применяется кислотный (НС1 или Н2SО4) гидролиз щелока, щелочной (NаОН) или комбинированный щелочной и кислотный. В настоящее время отбросный щелок от сепарации не используется, а выкачивается на поля орошения. В 1965 г. способом известковой сепарации должно быть обессахарено около 650 тыс. тонн мелассы. При переработке такого количества мелассы в отбросном щелоке будет содержаться (в тыс. т): глутаминовой кислоты 13, бетаина 19 и поташа 60. Для извлечения этих ценных продуктов из щелока предлагается схема, которая является комбинацией схем (особенно в части гидролиза), применяемых на заводах США в Сен-Джауси и Джонстауне. 17
На сахаро-баритовом заводе Джонстаун мононатриевый глютамат получают из щелоков после баритовой и известковой сепарации с применением сернокислотного гидролиза. Сконцентрированные до плотности 65% щелоки помещают в 4 резервуара-хранилища емкостью по 7500 тонн, из которых щелок подается в сборник 1, а из него на вакуум-фильтр 2 с намывным слоем. К фильтрату в сборник 3 добавляют Н2SО4 до рН 3,2 и выпавший осадок сернокислого калия отделяют на центрифуге 4. Сернокислый калий высушивают в ротационной сушилке и используют в качестве удобрения, а фугат снова фильтруют на вакуум-фильтре 5 с намывным слоем и выпаривают в аппарате 6 до содержания сухих веществ 70%. При выпаривании выпадает соль К2SО4, которую отделяют на центрифуге 7, а фугат подают в холодильник 8 и затем в кристаллизатор 9, где в течение 5 суток выкристаллизовывается сырая глютаминовая кислота. Отделенная от маточного раствора на фильтрпрессе 10 глютаминовая кислота поступает в сборник //, откуда подается в центрифугу 12. Там кристаллы кислоты осторожно промывают водой и выгружают в сборник 13. Затем разбавляют водой и перекачивают в сборник 14. Фильтрат, полученный на фильтр-прессе 10, нейтрализуют аммиаком и выкачивают в резервуар для хранения, откуда он используется на корм скоту. В сборник 14 к сырой глютаминовой кислоте добавляют кизельгур, активированный уголь и едкий натр для образования хорошо растворимой в воде мононатриевой соли; полученную суспензию фильтруют через фильтрпресс 15. Фильтрат охлаждают в холодильнике 16 и подают в сборник 17, где из мононатриевого глутамата путем добавления соляной кислоты до рН 3,2 вновь выделяют и отделяют на центрифуге 18 глютаминовую кислоту, которую собирают в сборнике 19. После вторичной очистки раствора кизельгуром и активированным углем в мешалке 20, фильтрации через фильтрпресс 21, кристаллизации в кристаллизаторе 22, отделения на центрифуге 23, сушки в сушильных аппаратах 24 и сортировки на ситах 25 получают чистый кристаллический глутамат натрия. 18
Представляет определенный интерес способ получения мононатриевого глутамата на заводе Сен-Джауси (США) с применением щелочного гидролиза (КаОН) по следующей технологической схеме. Поступающий в железнодорожных или автомобильных цистернах сгущенный щелок сливают в приемные резервуары /, из которых его подают в сборник на весах 2, а затем на вакуум-фильтр 3 с намывным слоем из вспомогательного фильтрующего материала (суспензию которого готовят в сборнике 4} для удаления взвешенных частиц, которые направляют в канализацию 5. Полученный фильтрат тщательно перемешивают в стальном гидролизаторе 6 с 50%-ным раствором едкого натра, который готовят в сборнике 7. Из сборника 8 в гидролизатор поступает пар. По окончании гидролиза жидкость охлаждают в теплообменнике 9, а затем в сборнике 10 подкисляют соляной кислотой, которую подают из сборника //. Поддержание необходимого рН раствора обеспечивается автоматическим рН-метром. Нейтрализованный раствор сгущают в однокорпусном выпарном аппарате 12; все части этого аппарата, cоприкасающиеcя с жидкостью и соковым паром, вплоть до конденсатора смешения, гуммируют, а поверхность нагрева и циркуляционный насос изготовляют из нержавеющей стали. В результате сгущения раствора из него выкристаллизовывается смесь хлористых натрия и калия, содержащая 30% К2О. Смесь этих солей отделяют на центрифуге 13 и направляют в сборник 14, откуда их после растворения направляют для получения неорганических побочных продуктов. После удаления неорганических солей к фугату в сборнике 15 добавляют соляную кислоту точно до рН 3,2, соответствующих изоэлектрической точке глютаминовой кислоты, что обеспечивается соответствующим автоматическим рН-метром. 19
Кислый раствор охлаждают в холодильнике 16, после чего направляют его в кристаллизаторы 17, в которых в течение 5—8 суток выкристаллизовывается сырая глютаминовая кислота. Отделение кристаллов проводят на центрифуге 19 после предварительного сгущения кристаллической массы в отстойнике Дорра 18. Декантат из отстойника направляют в сборник 20, а из сборника вместе с фугатом от центрифуг, собираемым в сборнике 21, фильтруют через фильтр 22. Взвешенный на весах 23 фильтрат направляют в сборник 24, откуда он поступает на извлечение бетаина и других побочных продуктов.Кристаллы сырой глутаминовой кислоты из центрифуги выгружают в сборник 25; затем в сборнике 26 разбавляют их водой и перекачивают в сборник 27. Для очистки сырой глютаминовой кислоты и перевода ее в хорошо растворяющуюся в воде мононатриевую соль к ней добавляют едкий натр, 50%-ный раствор которого подают из сборника 28, и активированный уголь со вспомогательным материалом для фильтрации, суспензию которых приготавливают в сборнике 29. Полученную смесь фильтруют через фильтр 30 и фильтрат под названием стандартного сиропа направляют в сборник 31. Сироп сгущают в вакуум-аппарате 32 и полученную массу направляют в кристаллизаторы системы Лафейля 33; поддержание установленной температуры в кристаллизаторах обеспечивается регулятором температуры 34. Кристаллы мононатриевого глутамата отделяют на центрифуге 35, высушивают в сушилке 36, просеивают через сито 37 и направляют в бункера 38, откуда готовый продукт поступает на расфасовку и упаковку 39. Фугат из центрифуги поступает в сборник 40, откуда его возвращают в основной процесс. Выход глутаминовой кислоты из сепарационного щелока принимают в среднем равным 2% к весу мелассы, а выход глутамата натрия примерно на 25% выше глутаминовой кислоты. Производство глутаминовой кислоты из мелассы В Италии фирмой Эрколи в 1956 г. освоено в промышленном масштабе производство глутаминовой кислоты, бетаина и поташа непосредственно из свекловичной мелассы по способу Сольвенте. В основе этого способа лежит обработка мелассы смесью метанола и бензола и высаливание в результате этого солей калия, затем последующая обработка частично обессахаренного и полностыо освобожденного от метанолбензола фильтрата ионитами. Из катионитового регенерата извлекают бетаин, а из анионитового — глутаминовую кислоту. Регенерацию катионита проводят серной или соляной кислотой, а регенерацию анионита — каустической содой. Способ Сольвенте интересен тем, что дает высокий выход продукции: сахара-песка 35% к весу патоки; пищевого сиропа 15%; глутаминовои кислоты 4%; бетаина до 6% и поташа 15% к весу мелассы. Группа японских специалистов института прикладной микробиологии Токийского университета во главе с проф. Т. Асаи нашла микроорганизм Micrococus glutamicus — глутаминовый микрококк, синтезирующий глутаминовую кислоту. В среде с аммонийной солью и глюкозой этот микрококк образует до 3 г глутаминовои кислоты на 1 л. 20
Биохимический способ получения глутаминовой кислоты Японской фирмой Kyowa Hatsuko разработан и осуществлен в промышленных условиях синтез глутамата натрия биохимическим методом сбраживания на крахмалистых и глюкозных средах. По лицензии этой фирмы американской фирмой Мегс построен и пущен в 1958 г. крупный завод. Технологическая схема производства глутамата натрия из мелассы биосинтезом, разработанная японской фирмой Nichon Tensaito. Свекловичная меласса подвергается разбавлению 1 водой до содержания сахара примерно 5%, затем стерилизуется паром 2 и охлаждается. В процессе подготовки к раствору мелассы добавляют мочевину, фосфорные и магниевые соли. Подготовленный раствор мелассы направляется на ферментацию 3 с применением глутаминового микрококка, синтезирующего из сахарозы глютаминовую кислоту. Ферментация ведется при продувании стерильным воздухом в течение 60 часов. Накопившаяся в процессе ферментации глютаминовая кислота (примерно 9,5% к раствору) отделяется от бражки фильтрацией 4 с добавлением кизельгура. Выделение глутаминовой кислоты из фильтрата и дальнейшее получение товарного глютамата натрия производится в аппаратах 5— 21 обычным методом. Оттек от центрифугирования 8 может быть использован для корма скоту или для выработки кормовых дрожжей. Общая продолжительность всего процесса до 9 суток. Метод дает высокий выход глутаминовой кислоты — 12% и более к весу мелассы, против 1,2— 2,0% при других методах. В результате снижения расхода химикатов, энергии и вспомогательных материалов себестоимость глютамата натрия, полученного биохимическим методом сбраживания, на 40—50% ниже по сравнению с полученным химическим методом. 21
Получение глютаминовой кислоты из мелассы с применением ионообменных смол. Производство глютамата натрия химическим методом связано с необходимостью применения сложной аппаратуры с антикоррозийным покрытием для защиты от агрессивных промежуточных продуктов и значительными затратами химикатов и энергии. Более совершенен в этом отношении способ извлечения глютаминовой кислоты по схеме французской фирмы Degremont с применением ионообменных смол, вырабатываемых другой французской фирмой Prosimafti. По этой схеме предусматриваются процессы деминерализации мелассы с одновременной очисткой и выделением из элюата ионообменников глютаминовой кислоты. Меласса поступает в аппарат / для разбавления и охлаждения; разбавленная примерно в 7 раз и охлажденная меласса направляется на катионообменник 2 для отделения солей калия и натрия, а также бетаина, после чего меласса поступает на анионообменник 3, на смоле которого задерживаются глютаминовая и пиролидонкарбоновая кислоты. Деминерализованная меласса в виде сахарного раствора с доброкачественностью 92% и выше направляется на сахарный завод для выделения сахара. После насыщения смол солями катионообменники и анионообменники переключают на процесс регенерации. Регенерация смол в катионообменнике проводится разбавленной серной кислотой с последующей промывкой умягченной водой. Элюат от регенерации катионообменных смол может поступать на выделение бетаина. 22
Регенерация смол в анионообменнике проводится раствором соды с последующей промывкой смол до нейтральной реакции умягченной водой. Элюат от регенерации смол из анионообменника направляется в сборник 4, а затем на сгущение в трехкорпусный выпарной аппарат 5. Сгущенный элюат обрабатывается раствором каустической соды в реакторе 6, фильтруется 7 и направляется в реактор 8 для обработки соляной кислотой. Образовавшиеся кристаллы отделяют на фильтре и затем растворяют в реакторе 9. Полученный раствор фильтруется через нутч-фильтр 10, куда для осветления вводится активированный уголь, и поступает в кристаллизаторы 11. Выкристаллизовавшаяся глютаминовая кислота отделяется на фильтре 12, сушится в этажерочной электрической сушилке 13 и упаковывается (14). Особенность описанной схемы — комплексная переработка мелассы на сахар, глютаминовую кислоту, бетаин и другие продукты при незначительном расходе химикатов и других вспомогательных средств. Производство полностью автоматизировано. По данным фирмы на 1 т глютамата натрия расходуется: соляной кислоты (32%-ной) в/п............. 6,0 едкого натра (50%-кого) в/п.............. 2,0 пара в т........................ 16,2 воды в м3........................ 230,0 электроэнергии в кет-ч................. 200,0 Также к способам получения глутаминовой кислоты относятся: • гидролиз различных белков; • синтез химический из α-кетоглутаровой кислоты; • ферментативный из α-кетоглутаровой кислоты; 23
24
К настоящему времени установлено, что способностью продуцировать глутаминовую кислоту обладают некоторые виды дрожжей и бактерий. Однако практически только бактерии могут синтезировать глутаминовую кислоту с выходом не менее 40% относительно исходного сахара или другого сырья. Поэтому промышленное значение имеют пока только бактерии, относящиеся к родам Micrococcus, Brevibacterium, Microbacterium, Corynebacterium. Это, главным образом, палочковидные, грамположительные бактерии, не образующие спор. Специфической для них является обязательная потребность в биотине либо в биотине и тиамине. Продукцию глутаминовой кислоты Corynebacterium glutamicum можно вызвать тремя основными способами: 1) поддержанием низкой (субоптимальной) концентрации биотина в ферментационной среде; 2) при оптимальной или превышающей её концентрации биотина продукция вызывается внесением в ферментационную среду поверхностно активных веществ, содержащих некоторые жирные кислоты (пальмитиновую или стеариновую), а также внесением самих жирных кислот (далее ЖК); 3) внесением в ферментационную среду антибиотиков, действующих на синтез клеточной стенки (пенициллин) 25 Микроскопия Corynebacterium glutamicum Corynebacterium glutamicum MB 001
26
К способам хранения продуцентов, можно отнести: Хранение на косом агаре при низкой температуре (1-5 ℃) в течение 1-2 месяцев. Для увеличения сроков хранения вплоть до 12 месяцев, ватные пробки пробирок можно залить парафином или обернуть пробирки медицинской пленкой. Засев в жидкую питательную среду или пересев на свежую агаризованную, осуществляется микробиологической петлей в стерильных условиях. Хранение штаммов в лиофильно высушенном состоянии (обезвоживание под вакуумом после замораживания при температуре -40- -60℃ и ниже).Для высева вскрывают ампулы,содержимое петлей переносят на агаризованную среду и помещают в термостат или в ампулу вносят 0,2-0,3 мл стерильной дистиллированной воды, растворяют материал и высевают содержимое. Хранение в глицероле (содержание при низких и сверхнизких температурах в растворах глицерола, который служит криопротектором). Применяется реже, так как необходимы предварительные эксперименты по определению степени выживаемости штамма-продуцента. Чаще всего применяется при хранении суспензий различных спор. После разморозки культуры, засев на питательные среды производится или микробиологической петлей или автоматической пипеткой со стерильным носиком. 27
28 Природный штамм микроорганизма Выявление и отбор продуктивного стабильного штамма на основе естественной изменчивости Передача продуктивного штамма в промышленное производство Получение продуктивного штамма Многократный пересев с контролем на образование требуемого продукта Обработка штамма мутагенами Выявление и отбор перспективных мутантов
Производственная культура микроорганизма-продуцента хранится в лаборатории предприятия в виде стока-посева в пробирке на жидкой или твердой питательной среде, предназначенной для среднесрочного хранения. В процессе хранения клетки микроорганизмов минимизируют свой метаболизм, поэтому передача их в производственный процесс проводится постепенно. Перед засевом в аппарат культура подращивается в термостате на специальной среде ( ночная культура). Цель этой стадии- “оживление культуры”, перевод из “спящего” состояния в активное-”инокулят”. 29
Состав питательной среды для главной ферментации и для получения посевного материала в значительной степени зависит от используемого продуцента, от его физиологических особенностей. Основным источником углерода в среде чаще всего являются глюкоза, сахароза, гидролизаты крахмала, свекловичная меласса, гидрол. Количество усваиваемого сахара в пересчете на сахарозу должно быть в пределах от 8,5 до 25%. Пределы использования мелассы определяются уровнем в ней биотина. Концентрация биотина, по данным большинства исследователей, не должна превышать 2–5 мкг на 1 л питательной среды, иначе вместо глутаминовой кислоты будут интенсивно накапливаться аланин, молочная, янтарная, аспарагиновая кислоты, резко возрастет прирост биомассы продуцента, но снизится выход глутаминовой кислоты. Помимо мелассы биотин в среду может быть внесен и с кукурузным экстрактом. Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01–0,2% или калиевой соли бензилпенициллина повышают биосинтетическую способность продуцента на 15–45% и выход глутаминовой кислоты достигает 50г/л. В качестве источника азота в питательных средах чаще всего используют мочевину в количестве до 1,5–2,0% в зависимости от особенностей используемого штамма, но вводится она дробно, по мере потребления ее из среды, и так, чтобы содержание ее в культуралыюй жидкости не превышало 0,8% и рН среды было в пределах от 6,8 до 7,8.Недостаток азота в среде приводит к снижению синтеза глутаминовой кислоты и к накоплению в среде повышенных количеств α-кетоглутаровой кислоты. Для нормального роста культуры и образования ею глутаминовой кислоты необходимо вводить в среду соли калия в виде КН 2 РО 4 до 0,1-0,2%; MgSO4*7H2O- до 0,03-0,3% MnSO4*4H20 до 0,001%, а также мел для поддержания рН среды на оптимальном уровне – около 7–7,2. Длительность культивирования зависит от содержания сухих веществ в среде, способа введения компонентов среды (единовременно или дробно), степени аэрации среды и, конечно, от физиологических особенностей продуцента. 30
Посевной материал готовят путем культивирования штамма-продуцента в течение 24 ч в асептических условиях на питательной среде следующего состава, %: Питательные среды на стадии основной ферментации вместо кукурузного экстракта и солей аммония содержат до 2 % мочевины, большее количество мелассы (до 20 %) и около 1 % мела (для стабилизации рН и как источник микроэлементов). Процесс биосинтеза ведут при температуре 28–30 °С, рН = 7,0÷7,2, интенсивной аэрации в течение 48–72 ч. При оптимальных условиях культивирования достигается достаточно высокий выход продукта.Выход глутаминовой кислоты при использовании Brevibacterium flavum достигает 50–55 г/л и выше. 31 меласса 8 кукурузный экстракт 0,3 хлорид аммония 0,5 двузамещенный фосфат калия 0,05 сульфат магния 0,03 синтетический пеногаситель (пропинол Б-400) 0,1
Далее приведены примеры различных сред для культивирования глутаминовой кислоты различными штаммами продуцентами. 32
Подготовку ферментаторов (инокуляторов) к работе начинают с промывки использованного оборудования горячей и холодной водой с последующей обработкой аппаратов и коммуникаций острым паром. Стерилизацию питательных сред осуществляют традиционным способом, так же как и подготовку технологического воздуха. Растворяемые компоненты среды нагревают до определенной температуры, затем выдерживают при этой температуре с последующим охлаждением до температуры ферментации. Питательная среда для выращивания продуцентов глутаминовой кислоты готовится и стерилизуется в две стадии с учетом свойств компонентов, входящих в ее состав. Стадия подготовки и стерилизация среды состоят из смешивания компонентов питательной среды в определенной пропорции с помощью специальных дозаторов в реакторе, растворения солей при перемешивании, нагрева до температуры стерилизации, выдержки при этой температуре в течение 1 часа и охлаждения до температуры, при которой проводится культивирование продуцента глутаминовой кислоты. Термолабильные компоненты среды, например мелассу, содержащую сахарозу стерилизуют отдельно. В реактор, снабженный мешалкой, подают мелассу и нагревают ее при постоянном перемешивании до температуры 80°С, с периодическим добавлением к раствору определенного количества воды. Собственно стерилизацию осуществляют путем быстрого разогрева полученного раствора глухим паром до 120–122°С в специальном аппарате и выдерживают при этой температуре определенное время, необходимое для полной гибели всей микрофлоры. Охлажденный раствор сжатым стерильным воздухом передают в предварительно подготовленный ферментатор. Температура стерилизации мелассы выше, а длительность значительно меньше, чем те же параметры при стерилизации остальных компонентов среды. Пеногаситель, используемый на стадиях культивирования продуцента в посевном аппарате и основном ферментере, особенно в том случае, когда им является масло или жир, стерилизуется отдельно. Режимы стерилизации (температура и длительность) при обработке пеногасителя более жесткие, чем это принято для стерилизации любых питательных сред. 33
При стерилизации аппаратуры режимы стерилизации зависят главным образом от материала, из которого изготовлено оборудование и его отдельные узлы. Наибольшая эффективность стерилизации аппаратуры и коммуникаций наблюдается при применении острого пара, имеющего температуру 135–140°С. Но отдельные блоки аппаратов, в том числе датчики измерительных приборов, не выдерживают таких условий стерилизации, и потому в этих случаях могут применяться «холодные» способы стерилизации. Для такой обработки могут быть использованы бактерицидные газы (этилен) и растворы химических реагентов (формалина, смеси цитилпиридинового бромида и этанолмеркурихлорида в соотношении 2:1, различные производные фенола и их смеси, аммонийные соли первичных и вторичных алкилсульфатов, хлорсодержащие соединения, 3-пропиоллактон и т.д.). Степень стерильности среды, оборудования и коммуникаций может быть проверена. Простерилизованную среду или смывы, произведенные стерильной водой с внутренних поверхностей аппаратов и трубопроводов, высевают на агаризованные или жидкие питательные среды и инкубируют в термостате сутки. Если среды остаются стерильными, то стерилизация проведена качественно. Такой анализ проводится при пуске завода, в случае появления инфекции и периодически в профилактических целях. Посевной материал на каждой из стадии его получения (от пробирок до посевного аппарата) выращивают в строго асептических условиях по 24 ч. Состав питательных сред незначительно меняется при переходе от одного штамма к другому и практически остается постоянным на каждой из промежуточных стадий получения посевного материала. Только при выращивании продуцента в посевном аппарате в питательную среду вносят до 0,1% стерильного синтетического пеногаситсля. Накопление биомассы до 6–8 г. АСВ на 1 л среды производят в аэробных условиях сначала в инокуляторах объемом 2 м 3, потом в посевных аппаратах объемом 5 м. Полученный посевной материал в количестве 5–6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы на 50 м 3. Коэффициент заполнения аппарата 0,7. 34
35
Выращивание продуцента в ферментере Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических условиях в ферментаторах объемом 50 м 3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48–52 ч и интенсивной аэрации [80–85 мг Ог/(л-мин)], что соответствует расходу 1 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28–30°С. В конце процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 45 г./л глутаминовой кислоты. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45–50%. Поскольку производство глутаминовой кислоты направлено на получение высокоочищенных препаратов, последующая технологическая схема предусматривает производство продуктов, подготовленных непосредственно к применению в качестве пищевых добавок и в виде лекарственных форм. 36 Промышленный ферментер BIORUS®
Предварительная обработка культуральной жидкости Осуществляется путем прогрева её глухим паром до температуры 35–85 °С в течение 30 мин и добавления к ней определенного количества негашеной извести (или известкового молока) (1%) с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой до рН 5,5–7,0. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей. Отделение биомассы от культуральной жидкости Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением с помощью фильтр пресса. При получении глутаминовой кислоты культуральную жидкость нагревают до 60–65 ° С с целью докоагуляции клеток и направляют на рамный фильтр-пресс, где фильтруют. Осадок промывают и обезвоживают продувкой воздухом в течение нескольких часов. Нативный раствор и промывные воды объединяют, при необходимости корректируют рН до 5,5–6,0 концентрированной соляной кислотой и передают на дальнейшую переработку 37
Осветление фильтрата Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем или подвергают его ионообменной сорбции на анионите ИА-1P. Нативный раствор глутаминовой кислоты, подкисленный 33 %-й соляной кислотой до рН 4,5–5,5 с содержанием сухих веществ около 9 % поступает на осветление в колонну с сорбентом ИА-1Р. Цикл работы одной колонны с сорбентом ИА-1Р включает следующие операции: • Процесс сорбции пигментов на регенерированном сорбенте. Нативный раствор глутаминовой кислоты подают сверху вниз со скоростью 0,5–1,0 ч-1. Осветлённую жидкость сливают в ВВУ для последующего упаривания или в промежуточный сборник. • Вытеснение осветленного раствора и промывка сорбента водой. Раствор из межгранульного пространства вытесняют обессоленной водой или конденсатом пара с ВВУ в количестве 1,5 объёма/1 объём сорбента со скоростью 0,5 ч-1. Раствор глутаминовой кислоты подают сверху вниз. • Регенерация сорбента. Регенерация проводится сверху вниз 0,5 н раствором гидроксида натрия и 1,2 н раствором аммиака в количестве 2 объёма/1 объём сорбента со скоростью 1 ч-1. 38
Сильноокрашенный промывной раствор сливают в канализацию, слабоокрашенный используют в дальнейшем повторно, собирая в отдельную ёмкость для хранения. От щёлочи смолу отмывают водопроводной водой из расчёта 3 объёма воды/1 объём сорбента со скоростью 1 ч -1. Щелочной раствор с концентрацией гидроксид-ионов больше 1 моль/л собирают для повторного использования, остальные промывные воды сливают в канализацию. Затем снизу вверх пропускают 1 %-й раствор соляной кислоты из расчёта 1–1,5 объёма/1 объём сорбента со скоростью 1 ч -1. Стоки направляют в канализацию. Смолу снова промывают водой сверху вниз из расчета 2 объёма воды/1 объём смолы со скоростью 1 ч -1 до величины рН 2,0–2,5. Смола выдерживает 300 циклов. Элюат направляют на вакуум-выпаривание. Концентрирование осветленного раствора глутаминовой кислоты Проводят путем его вакуум-выпаривания при температуре 40–60 °С, при этом из исходного раствора глутаминовой кислоты отгоняют от 50 до 80% воды. Режимы вакуум-выпаривания растворов глутаминовой кислоты 39 Аминокислота Температура,°С Р, атм Содержание, % СВ Примечание Содержание аминокислоты в упаренном растворе, % Глутаминовая кислота 60–70 0,70–0,75 43–45 Препарат пищевого назначения 15–17
40 Вакуумный выпариватель с тепловым насосом AQUADEST-K Кристаллизатор SCR SHINI
Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты в изоэлектрической точке Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 (изоэлектрическая точка глутаминовой кислоты) и охлаждения раствора до 4–15°С в кристаллизаторе. Однократное проведение операции обеспечивает кристаллизацию 77% глутаминовой кислоты; при повторном ее проведении выход возрастает до 87%. Чистота получаемых кристаллов достигает 88%. В результате последующей перекристаллизации чистоту получаемых кристаллов можно увеличить до 99,6%, что удовлетворяет требованиям фармакопеи. Отделение кристаллов глутаминовой кислоты от маточника Это достигается центрифугированием с последующей декантацией и возвратом маточника на стадию вакуум-выпаривания. Суспензию кристаллов глутаминовой кислоты помещают в фильтрующую центрифугу и центрифугируют при 5000–6000 об/мин в течение 0,5–1,0 ч. Кристаллы распределяются по периферии ротора толщиной 1–5 см. Кристаллы промывают холодной водой (10°С) в течение 15–20 мин. Объём воды составляет 10–15 % от объёма исходной суспензии Полученные кристаллы с содержанием основного вещества не ниже 96 % (в случае глутаминовой кислоты) промывают обессоленной водой и направляют на сушку. 41 Центрифуга EquipNet.Inc
Сушка кристаллов глутаминовой кислоты Проводится в вакууме или в токе нагретого воздуха при 60-70°С. 42 Барабан вакуумной сушки BIORUS GV150
В производстве глутаминовой кислоты маточные растворы перерабатываются в продукт ГМЖ (глутаминовый маточник с жомом), в состав которого входит свекловичный жом или высушенная биомасса продуцента, или пшеничные отруби. Маточный раствор (вместе с промывными водами) представляет собой жидкость коричневого цвета, содержащую 35–37 % СВ, из которых 75 % приходится на органические вещества. Содержание глутаминовой кислоты составляет 5–8 %, других аминокислот 4–5 %, сахаров 3–15 %, азотистых веществ 8–12 % от суммы органических веществ. В производстве ГМЖ маточный раствор упаривают в ВВУ до 45–50 % СВ и собирают в сборник. В смеситель загружают свекловичный жом и приливают упаренный маточник до соотношения 1:1 по массе. С целью получения однородной массы смесь перемешивают в течение 2 ч. Затем высушивают в распылительной сушилке горячим воздухом с температурой на входе 120–125 °С и на выходе 65–70 °С до остаточной влажности 10–12 %. Выход ГМЖ составляет 7,5–9,0 кг/кг глутаминовой кислоты. В производстве глутаминовой кислоты предусматривается производство ещё одного кормового препарата – ОБГК (осажденная биомасса глутаминовой кислоты), который на 30 % состоит из органических веществ и на 70 % из ортофосфата кальция. Производство ОБГК включает следующие операции: • Осадок биомассы снимают с фильтр-пресса, продувают горячим воздухом и подсушивают до 20–40 % СВ, затем сбрасывают в бункер, подают транспортёром на гранулятор и далее на ленточную сушилку. Сушат биомассу так же, как и ГМЖ. • Сухие гранулы ОБГК, содержащие 6–8 % влаги пневмотранспортом подают на фасовку по 15 – 20 кг в бумажные крафт-мешки с полиэтиленовым вкладышем. Полиэтиленовый вкладыш заклеивают, мешки зашивают на мешкозашивочной машине. Выход ОБГК – до 2 кг/кг моногидрата глутамата натрия. 43
Принципиальная аппаратурная схема получения глутаминовой кислоты на примере ОБГК 44
Обычно глутаминовую кислоту выпускают в виде натриевой соли – глутамата натрия. Для получения глутамата натрия влажные кристаллы с содержанием 98–99% глутаминовой кислоты по сухой массе растворяют и нейтрализуют 45–50%-ным раствором NaOH до рН 6,8. Расход гидроксида натрия составляет 90 % от требуемого по стехиометрии для получения моногидрата глутамата натрия. Для лучшего растворения смесь нагревают до 60–80 °С глухим паром. Далее происходит фильтрация горячего раствора на нутч-фильтре через слой активированного угля для очистки от взвешенных частиц и пигментов. Уголь берут в количестве 1,5 % от массы раствора. Затем его промывают водой, взятой в количестве 5 % от массы исходного раствора. Промывные воды объединяют с фильтратом, а уголь повторно используют в производстве глутаминовой кислоты на стадии перекристаллизации. Фильтрат подщелачивают 40 %-ым раствором гидроксида натрия до рН 6,8–7,0 и направляют на вакуум-выпарную установку (ВВУ). Упаривание раствора глутамата натрия проводят на ВВУ в тех же условиях, что и в производстве глутаминовой кислоты до содержания 57–60 СВ % (63–66 % в расчете на моногидрат). Конденсат собирают и используют в производстве. Упаренный раствор заливают в аппарат-кристаллизатор и кристаллизуют до содержания глутамата натрия в маточном растворе 40 г/л. Суспензию кристаллов направляют на центрифугирование. Центрифугирование осуществляют так же как и в производстве глутаминовой кислоты при 5000–6000 об/мин в течение 0,5–1,0 ч. Полученные кристаллы имеют влажность около 6 %. Их направляют на сушку в вакуум-сушильном шкафу. Маточный раствор используют для приготовления суспензии глутаминовой кислоты на стадии нейтрализации. Такую операцию проводят не более 5 циклов подряд, а далее маточный раствор возвращают на стадию производства подкисленного фильтрата культуральной жидкости. 45
46 Ленточная сушилка Evolum® Нутч-фильтр «Спб Актив»
На биосинтез глутаминовой кислоты существенное влияние оказывают степень аэрации среды, перемешивание, рН среды, длительность и температура ферментации, возраст и доза посевного материала. Поэтому на всех стадиях процесса все параметры культивирования строго регламентируются и контролируются (температура, рН, изменение основных компонентов среды, накопление глутаминовой кислоты, аэрация, перемешивание и т.д.). Уровень рН среды. Это очень ответственный параметр процесса. Как известно, продуцентами являются бактериальные штаммы, и потому в большинстве случаев оптимум рН для культивирования лежит в области, близкой к нейтральной или слабощелочной. Для штаммов, используемых в нашей стране, наилучшие результаты по биосинтезу глутаминовой кислоты получаются, если рН среды поддерживается около 7–7,2. Для всех известных продуцентов глутаминовой кислоты рН, обеспечивающей максимальное накопление глутаминовой кислоты и рост культуры, лежит в пределах от 6 до 8,5. Аэрирование Снабжение растущей культуры кислородом является ответственным и важным фактором, влияющим на рост микроорганизма и образование им продукта. Кислород, используемый бактериальной клеткой, должен быть растворен в питательной среде. Для увеличения растворимости кислорода осуществляют барботирование среды воздухом с одновременным ее перемешиванием. Оптическая плотность Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза содержание глутаминовой кислоты в культуральной жидкости достигает не менее 45 г./л, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5–1,0%. 47
Глутаминовая кислота продаётся в аптеках в форме таблеток. Условия хранения: в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 25 °С. Сроки хранения - 3-4 года. В форме порошка срок годности чаще всего 1-3 года. Условия хранения аналогичные: хранение в сухом прохладном месте, защищенном от света, в плотно закрытой упаковке при температуре не выше 25°С и относительной влажности воздуха не более 75%, в оригинальной упаковке. 48
Промышленная биотехнология : электронный курс лекций для студентов специальности 1-48 02 01 «Биотехнология» / Н. С. Ручай, О. В. Остроух. – Минск : БГТУ. - 2013. – С. 23-27 Фармацевтическая биотехнология: Производство биологически активных веществ: учеб. пособие : в 2 ч. - Ч.2./ Ю.М. Краснопольский, Н.Ф. Клещев. - Харьков: НТУ “ХПИ”. - 2019. - С.25-27 Нижегородова Т. А., Гусева Е. В., Меньшутина Н. В., Будран Ж., Горжен Ж. -л, Гедон Э., Делонэ C., Фурнье Ф. Математическое моделирование производства L-глутаминовой кислоты // Известия ВУЗов. Химия и химическая технология. - 2007. - №10. - С. 93-97 Нижегородова Т. А. Исследование процессов микробиологического синтеза в условиях теплового шока (на примере получения Lглутаминовой кислоты):дис....К.т.н.:05.17.08 Процессы и аппараты химической технологии, защищена в 2007. - Московский Государственный Университет Прикладной Биотехнологии (МГУ ПБ).- Российская Федерация. -2007. - 92 с. Тринеева О. В. Теоретические и методологические подходы к стандартизации и оценке качества лекарственного растительного сырья и масляных экстрактов на его основе:дис....Д.ф.н.:14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия, защищена в 2016. - Воронежский государственный университет. - Российская Федерация. -2016. - 441с. Глутаминовая кислота и ее соли | Импорт и Экспорт | 2019 [Электронный ресурс]: база данных. / TrendEconomy. – База данных – Болгария, 2021. -. – режим доступа к базе данных.: https://trendeconomy.ru/abou t Краткий обзор рынка глутамата натрия [Электронный ресурс]: база данных. / Исследовательская компания «Abercade». – База данных – Млсква, 1999-2021. -. – режим доступа к базе данных.: http://www.abercade.ru/ Сыровая А.О., Шаповал Л.Г., Макаров В.А., Петюнина В.Н., Грабовецкая Е.Р., Андреева С.В., Наконечная С.А., Бачинский Р.О., Лукьянова Л.В., Козуб С.Н., Левашова О.Л. Аминокислоты глазами химиков, фармацевтов, биологов: в 2-х т. Том 1 / − Х. «Щедра садиба плюс», 2014 – С.27-83 Гусятинер М. М. Создание продуцентов аминокислот на основе бактерий Corynebacterium glutamicum и Escherichia coli; исследование механизмов продукции:дис...Д.б.н.: 03.02.07 – Генетика, защищена в 2017. - Закрытое акционерное общество «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика». -Российская Федерация. -2017. - 231с. Музыченко Л.А. Принципы синтеза математических моделей микроорганизмов. //Микробиологическая промышленность. 1974. - № 2. - С. 3-6. Uy D, Delaunay S, Germain P, Engasser JM, Goergen JL. Instability of glutamate production by Corynebacterium glutamicum 2262 in continuous culture using the temperature-triggered process/ J Biotechnol. - 2003. - V. 104. - P.173–184. Van der Rest ME, Lange C, Molenaar D. A heat shock following electro-poration induces highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA / Appl Microbiol Biotechnol. - 1999- V.52. - P.541–545 49
