Культура клеток - это выращенные in vitro (вне организма) на специальных средах клетки различных тканей животных и человека, в том числе лейкоциты, сохраняющие присущие им обмен и восприимчивость к определенным вирусам.
ПОСУДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
ПОСУДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК чашки Петри
Отделение клеток с рабочей поверхности культуральной посуды механическим способом (www.4science.net). Примеры скребков для отделения клеток с различной рабочей частью (www.4science.net).
Стандартные роллеры Роллеры с увеличенной поверхностью Ребристая структура стенок флаконов
Процесс образования монослоя можно пронаблюдать в инвертированный микроскоп
Матрасы с культурой клеток ВНК-21 ( почки новорожденного сирийского хомячка ) стационарное культивирование Лабораторная посуда для выращивания культур клеток
Роллеры с культурой клеток ВНК-21(сl-13), объемом 2, 3, 4 литра
Снятие клеток скребком в культуральном сосуде без предварительной трипсинизации.
Схема получения первичной культуры клеток путем механической и ферментативной дезагрегации
Магнитная мешалка для трипсинизации тканей
Подготовка гемоцитометра. клеточную суспензию добавляют равный объем 0,1%-ного трипанового синего. Этот краситель окрашивает только мертвые клетки. Шлифованное покровное стекло притирают к предметному стеклу гемоцитометра
Подсчет клеток в камере Горяева.
Подсчитывают количество клеток в четырех больших квадратах в углах каждой из двух заштрихованных бластей. Считают клетки, касающиеся правой и верхней ограничивающих линий, но не клетки, касающиеся левой и нижней ограничивающих линий. Поскольку объем большого квадрата составляет 0,1 мм 3, то, умножив усредненное значение числа клеток в одном квадрате на 10 4, получают количество клеток в 1 мл суспензии. Подсчет живых клеток в гемоцитометре (по R.L.P. Adams)
ОБОРУДОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОГО БОКСА
Основное оборудование для культуральных работ — ламинарный шкаф. Обеспечивает равномерный вертикальный поток стерильного воздуха, защищая культуру клеток от микробного заражения.
http://old.kpfu.ru/nilkto/cell/rasdel3/r3_p1.html
Кисти рук должны находиться между горелкой и задней стенкой ламинара.
Пластиковые планшеты, Чашки Петри, Стеклянные флаконы, Плоскодонные бутыли Сосуды Карреля Посуда,которая применяется при культивировании клеток.
Питательные среды готовятся переливанием в один флакон всех составных частей в направлении уменьшения объема (DМЕМ -> ИГЛА -> среда 199 -> и т. д.).
Все сосуды со знаком "+" залиты рассчитанным количеством среды, приступают к рассеву клеточной суспензии в новые сосуды.
Стеклянная пипетка погружается в сосуд со знаком "+". Клеточная суспензия набирается в пипетку (приблизительно до половины ее высоты) и с силой выпускается обратно в сосуд.
Эта операция проделывается несколько раз для того, тобы дезагрегировать клеточные кластеры и обеспечить в дальнейшем равномерный рассев клеток иприкрепление их к субстрату.
Культивирование в колонках на микроносителях, в качестве которых выступают плотно упакованные, не смещающиеся стеклянные бусы диаметром 35 мм, стопка пластин и др., а питательная среда омывает их, протекая сверху вниз.
30 Суспензионное культивирование
Волновой биореактор: (а) схема процесса культивирования, (б) волновой биореактор 20/50с одноразовым мешком а б
Морфология клеток разного происхождения: а - эпителиоподобная ( MDCK, почка собаки), б - фибробластоподобная ( М, кожа индийского мунтжака), в - нейробластоподобная ( N В41АЗ, нейробластома мыши), г-лимфобластоподобная ( U -937,гистиоцитарная лимфома чел - а) в а г б
Модульная расширяемая роллерная установка для культивирования клеток CELLROLL
Модульная расширяемая роллерная установка для культивирования клеток CELLROLL
Роллерный биореактор для культивирования адгезивных клеточных культур: (а) схема, (б) система роллерного культивирования
Внутренний объем термостата с инкубируемыми культурами клеток (www.upload.wikimedia.com) Термостат для культивирования культур клеток (www.biophysics.com)
Внутренний объем термостата с инкубируемыми культурами клеток (стационарное культивирование)
Мофология широко используемых культур клеток животных: а – фибробласты; б – эпителиальные клетки; с – мышечные клетки; d – лимфоциты; e - нейроны а б с d е
Формирование монослоя клеток Когда клетки занимают все пространство культурального матраса (это видно невооруженным глазом или при помощи бинокуляра), сливают ростовую среду и используют клетки для заражения или пересева.
Первичная культура фибробластов человека
Кардиомиоциты (крыса)
Рост миобластов в культуре Процесс образования монослоя можно пронаблюдать в инвертированный микроскоп. Клетки, достигшие состояния монослоя, нуждаются в пересеве.
Культура клеток человеческого фибробласта (www.krackeler.com) Культура клеток Vero эпителиоподобного типа (www.cdc.gov)
Методы выявления и идентификации вирусов в клеточных культурах Существуют основные методы индикации (обнаружения) вирусов в КК - по цитопатическому эффекту (ЦПЭ) или цитопатическому действию (ЦПД); по выявлению внутриклеточных включений; электронной микроскопией; с помощью реакции ИФА, ИФ; в реакции гемадсорбции ; по выявлению интерференции вирусов; по угнетению метаболизма клеток (цветная проба); - по образованию бляшек.
В зависимости от свойств вируса и типа заражаемых им клеток взаимодействие вируса с клетками и изменения в них могут быть следующими: Цитопатический эффект (ЦПЭ) — развитие дегенеративных процессов в клетках. Образование симпластов и синцитиев — гигантских многоядерных клеток в результате слияния цитоплазмы нескольких клеток и митотического деления. Образование включений — одно из проявлений ЦПЭ. Увеличение массы вирусов — образование бляшек или колоний вирусов (например, у вирусов оспы, кори, полиомиелита и др.)
ЦПД вируса ИРТ КРС штамм «ВНИИЗЖ» в клеточной культуре RBT (×40) неинфицированная культура культура ч/з 18-20 ч после зараж культура ч/з 20-28 ч после зараж культура ч/з 48-52 ч после зараж
SSF-1 Морфология клеточных линий плавников сибирского осетра Окраска по Паппенгейму. Масштабная линейка - 20 мкм. Популяция клеток линии SSF-1 представлена как эпителио- так и фибробласто подобными клетками. В первые 7 суток после посева преобладают в основном эпителиоподобные клетки. Эти клетки отросчатые, распластанные по субстрату, с размытыми краями. Контакты между клетками неплотные, с большим межклеточным пространством. Ядра средних размеров, овальной формы, с четко очерченными границами. Цитоплазма и кариоплазма гомогенны. Количество ядрышек от 1 до 7, чаще 2-3 на клетку.
SSF- 2 Морфология клеточных линий плавников сибирского осетра Окраска по Паппенгейму. Масштабная линейка - 20 мкм. Монослой линии SSF-2 состоит из рыхло лежащих фибро бластоподобных клеток, расположенных пучками. Цитоплазма клеток выглядит неоднородной, с интенсивно и слабоокрашенными участками. Ядра клеток крупные, кариоплазма гомогенная. Количество ядрышек от 1 до 6, чаще 3-4 на клетку.
ЦПД в культуре клеток SSF-2 рабдовируса весенней виремии карпа (А) ЦПД проявлялось в виде округления клеток, разрежения монослоя и появления клеток с длинными тонкими отростками, придающими пораженной культуре клеток вид сеточки
Отличительной особенностью герпесвирусного ЦПД в культуре клеток SSF-2 было слияние клеток и образование многоядерных симпластов. Количество ядер в симпластах м.б. до дести. На поздних стадиях инфекции симпласты постепенно округлялись, приобретая форму шара, который крепился к субстрату длинными отростками. Постепенно симпласты утрачивали связь с субстратом и переходили во взвешенное состояние. ЦПД в культуре клеток SSF-2 герпесвируса сибирского осетра (Б)
. Метод бляшек
Реакция гемадсорбции
Учёт реакции гемагглютинации
ЭНДОТЕЛИОЦИТЫ ЧЕЛОВЕКА ФИБРОБЛАСТЫ КРЫСЫ
Сосуды для хранения образцов в жидком азоте с электронным контролем уровня азота
Лабораторные низкотемпературные морозильные камеры DFU (-40 – 86 о С) (а) и сосуды Дьюара с хранилищем для биоматериалов (б). б а
Наиболее полная коллекция — ATCC в США — насчитывает более 4600 клет. культур эукариот, можно купить; они детально охарактеризованы. Это позволяет подобрать наиболее подходящие для конкретного исследования..
Снятие клеток скребком после фиксации в культуральном сосуде без предварительной трипсинизации.
Результаты реакции гемагглютинации Ряд А : лунка 1 - реакция положительная на 4 плюса, 2-8 на 3 плюса, 9-на 2 плюса, 10-на 1 плюс, 11-12 минус. Ряд – Б : лунка 1-реакция положительная на 3 плюса, 2- на 2 плюса, 3- на 1 плюс, 4-12 – минус
