Лекция № 13-14 ОТДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И МОДИФИКАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ. ПРОЦЕССЫ И АППАРАТЫ К.б.н. Садвакасова А.К.
1 Отделение биомассы. 2 Методы разрушения клеток. 3 Отделение и очистка продуктов. 4 Концентрирование, модификация, стабилизация продукта. Основные вопросы :
Завершающие стадии биотехнологических процессов — выделение и очистка целевого продукта. Технология выделения и очистки в значительной степени определяется природой целевого продукта. В ряде случаев существует возможность не использовать тщательную очистку продукта, если он обладает требуемыми активностями в неочищенном состоянии и если примесь посторонних веществ не оказывает каких-либо нежелательных влияний при его использовании. Некоторые традиционные биотехнологические процессы вообще исключают этап отделения продукта.
1 ОТДЕЛЕНИЕ БИОМАССЫ Первым этапом в процессе очистки целевого продукта является разделение культуральной жидкости и клеточной биомассы — сепарация. Методы сепарации Флотация Фильтрация Центрифугирование
Флотация Метод используется в том случае, если клетки продуцента в силу низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях содержимого биореактора. Особые устройства (флотаторы) различной конструкции удаляют образующуюся при культивировании пену вместе с прилипшими к пузырькам газа клетками. Повышение эффективности отбора биомассы достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя механическим путем. Достоинствами метода являются его экономичность, высокая производительность и возможность использования в непрерывных процессах.
Фильтрация Различные применяемые в настоящее время фильтрующие системы (барабанные, ленточные, тарельчатые фильтры, карусельные вакуум-фильтры, фильтры-прессы, мембранные фильтры) основаны на одинаковом принципе – задержке биомассы на пористой фильтрующей перегородке. Недостатком способа является налипание клеток на фильтре, слой которых снижает скорость протока жидкости в процессе фильтрования. Для фильтров непрерывного действия предусматриваются системы автоматической очистки от биомассы, забивающей поры. Она может сдуваться с поверхности фильтров сжатым воздухом или удаляться специальными "ножами". Существуют также фильтры для многократного или однократного периодического использования. Например, мембранные фильтры, позволяющие фильтровать очень разбавленные клеточные взвеси. Однако проблемой их использования является быстрая закупорка пор клетками, белками и другими коллоидными частицами.
Центрифугирование Под центрифугированием понимают процесс разделения неоднородных систем, суспензий и эмульсий, в поле центробежных сил с использованием специальных оборудований - центрифуг.
Данный способ требует более дорогостоящего оборудования, чем фильтрование, поэтому он применяется, если: а) суспензия фильтруется слишком медленно; б) возникает необходимость максимального освобождения культуральной жидкости от содержащихся в ней частиц; в) требуется обеспечить непрерывный процесс сепарации, когда фильтры рассчитаны на периодическое действие. Центрифугирование
По физической сущности реализуемого процесса центрифуги подразделяют на фильтрующие и осадительные (отстойные). Рабочим органом центрифуги является ротор (барабан), закрепленный на вращающемся валу, во внутреннюю полость которого подается суспензия. По расположению вала ротора центри ф уги делятся на вертикальные и горизонтальные. А по режиму работы выделяют центрифуги периодического и непрерывного действия. Наиболее используемые типы центрифуг периодического действия – маятниковые и горизонтальные с ножевой выгрузкой осадка. Маятниковые центрифуги получили название из-за колебательного движения корпуса во время работы. Конструктивная особенность этих машин – вертикальное расположение вала ротора и наличие трех колонок, в которых размещены тяги упругой подвески с шаровыми шарнирами и пружинами. Центрифугирование
В горизонтальных центрифугах с ножевой выгрузкой осадка все операции рабочего цикла выполняются при одинаковой частоте вращения ротора, как правило, в автоматическом режиме.
Схема камерного сепаратора: 1 – корпус; 2 – червячная пара; 3 – тахометр; 4 – бобышка; 5 – вал; 6, 7, 8 – ротор в сборе; 9 – напорный диск; 10 – крышка; 11 – гайка; 12 – уплотнение; 13 – штуцер; 14 – кран; 15 – манометр; 16 – шток; 17 – подача суспензии; 18 – сгон; 19 –корпус барабана; 20 – барабан; 21 – опора; 22 – нижняя опора; 23 – приемник осадка; (в): 1 –статор; 20 – барабан По конструкции сепараторы разделяют на тарельчатые и камерные. По технологическому назначению сепараторы делятся на три основных класса: сепараторы-разделители для разделения смеси жидкостей, не растворимых одна в другой, и для концентрирования суспензий и эмульсий; сепараторы-осветлители для выделения твердых частиц из жидкости; комбинированные сепараторы для выполнения двух или более операций переработки жидких смесей. Сепараторы
2 МЕТОДЫ РАЗРУШЕНИЯ КЛЕТОК Разрушение клеток проводится физическими, химическими и ферментативными методами. Наибольшее промышленное значение имеют физические способы дезинтеграции: 1) ультразвуком; 2)лопаточными или вибрационными дезинтеграторами - метод, обычно используемый в пилотных и промышленных установках; 3)встряхиванием со стеклянными бусами; 4) продавливанием через узкие отверстия под высоким давлением ( экструзионные методы); 5) раздавливанием замороженной массы; 6) растиранием в специальных ступках; 7) с помощью осмотического шока; 8) многократным замораживанием и оттаиванием; 9) сжатием клеточной взвеси с последующим резким снижением давления (декомпрессией).
Физические способы дезинтеграции отличаются большей экономичностью в сравнении с другими методами, однако они характеризуются отсутствием выраженной специфичности, вследствие чего обработка может отрицательно влиять на качество получаемого целевого продукта.
Экструзия – продавливание суспензии клеток через капиллярные отверстия. Для обработки жидких или замороженных суспензий. D отверстий рабочих матриц 0,1 – 10 мм. Гидроэкструдеры – 2000-4000 кг/см 2 Твердофазовые – 10000-50000 кг/см 2
Химические и ферментативные методы обеспечивают мягкое и избирательное разрушение клеточной стенки. Так, бактериальные клетки разрушаются лизоцимом в присутствии ЭДТА ( этилен-диаминтетрауксусной кислоты), а клеточные стенки дрожжей зимолиазой улитки или ферментами грибного либо актиномицетного происхождения. Клеточные стенки микроорганизмов могут быть разрушены путем обработки толуолом или бутанолом. Элективный лизис клеток вызывается воздействием ряда антибиотиков: полимиксин, новобиоцин, нистатин и др. После дезинтеграции клеток необходимо избавляться от их "обломков", для чего используют те же методы, что и при сепарации, т.е. центрифугирование или фильтрацию.
3 ОТДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОДУКТОВ Выделение целевого продукта из культуральной жидкости или получаемого в результате процессов дезинтеграции гомогената разрушенных клеток осуществляется путем осаждения, экстракции или различных методов адсорбции.
Осаждение растворенных веществ осуществляется физическими (нагревание, разведение или концентрирование, охлаждение раствора) или химическими воздействиями, переводящими растворенное вещество в малорастворимое состояние.
Экстракция подразделяется на твердо-жидкофазную (при которой продукт из твердой фазы переходит в жидкую) и жидко- жидкофазную (когда обеспечивается перевод продукта из одной жидкой фазы в другую, также жидкую фазу). Твердо-жидкофазная экстракция сводится порой к простой обработке твердого образца водой или органическим растворителем с целью извлечения из него растворимых соединений. Достаточно широко применяются различные органические растворители, в частности экстрагирование ацетоном, который эффективно переводит в раствор ряд липидных и белковых компонентов клеток. При жидко-жидкофазной экстракции используются различные органические растворители - алкилфенолы, эфиры, галогениды, гексан, хлороформ и др. Почти полностью избежать инактивации позволяют методы экстрагирования на холоде, т. е. путем использовании методов криоэкстракции. При этом уравниваются различия между твердым субстратом и культуральной жидкостью, поскольку и то и другое находится в замороженном состоянии (в одной фазе). Криоэкстракция проводится с применением растворителей, температура кипения которых низка и при обычной комнатной температуре находится в газообразном состоянии.
Адсорбция является достаточно распространенным методом отделения продукта и рассматривается в качестве частного случая экстракции, при котором экстрагирующим агентом служит твердое тело. Механизм ее сводится к связыванию выделяемого из жидкой или газообразной фазы вещества поверхностью твердого тела. Традиционными адсорбентами являются древесный уголь, пористые глины и т. п. Более современные методы разделения веществ включают хроматографию, электрофорез, электрофокусировку, которые основаны на принципах экстракции и адсорбции.
Хроматография (от греч. chroma – цвет, краска и - графия ) – физико-химический метод разделения и анализа смесей, основанный на распределении их компонентов между двумя фазами – неподвижной и подвижной (элюент), протекающей через неподвижную. Виды хроматографии по технике выполнения: колоночная - разделение веществ проводится в специальных колонках плоскостная: - тонкослойная (ТСХ) – разделение проводится в тонком слое сорбента; -бумажная – на специальной бумаге. 24
метод очистки и разделения белков, основанный на их взаимодействии со специфическим лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем матрицей
Для крупномасштабного отделения и очистки продуктов биотехнологических процессов применимы: аффинная преципитация - лиганд прикрепляют к растворимому носителю, при добавлении смеси, содержащей соответствующий белок, образуется его комплекс с лигандом, который выпадает в осадок сразу после его формирования или после дополнения раствора электролитом. 26
аффинное разделение - основано на применении системы, содержащей два водорастворимых полимера – наиболее высокоэффективный из аффинных методов очистки. гидрофобная хроматография основана на связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхности белковой глобулы. 27
4 КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ, ОБЕЗВОЖИВАНИЕ, МОДИФИКАЦИЯ И СТАБИЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОДУКТА За отделением продукта следует этап его концентрирования с помощью основных методов: - обратного осмоса, - ультрафильтрации, - выпаривания.
При методе обратного осмоса концентрируемый раствор помещается в мешок из полупроницаемой мембраны, снаружи создается осмотическое давление, превышающее осмотическое давление раствора, в результате чего растворитель начинает вытекать через мембрану против градиента концентрации растворенного вещества, обусловливая дальнейшее концентрирование раствора. Ультрафильтрация представляет собой способ концентрирование вещества с помощью мембранных фильтров. Этот метод перспективен при концентрировании малостабильных продуктов (некоторые аминокислоты, антибиотики и ферменты).
Метод выпаривания наиболее древний и обладает существенным недостатком: для удаления растворителя концентрируемый раствор следует нагревать, но, тем не менее, данный способ достаточно широко используется, особенно в лабораториях. В производственных условиях чаше применяются вакуумные испарители, обеспечивающие более щадящий режим концентрирования. Нагревающим агентом обычно служит водяной пар, хотя используется также обогрев жидким теплоносителем или электрическими нагревателями. Концентрирование методом выпаривания может ограничиваться стадией получения сиропообразного раствора целевого продукта; такая процедура называется упариванием и получаемый продукт относится к категории жидких. Дальнейшее освобождение от влаги достигается путем особой стадии - сушки.
Остаточная влажность большинства продуктов микробного синтеза 5-12%. Объекты сушки : живые МО, клетки, ферменты, медикаменты и другие БАВ. 2 способа обезвоживания: Механический, без изменения агрегатного состояния. Удаляется основная часть влаги. Тепловой, с изменением АС воды из жидкого в парообразное. Выпаривание (не позволяет получить конечный продукт в сухом виде). Основной промышленный способ – тепловая сушка.
вида исходных материалов (влажная паста, густая суспензия, высококонцентрированный раствор) свойств исходных материалов (влажность, термоустойчивость, ксерочувствительность, структурные и теплофизические параметры, химический состав). Наибольшие трудности – сохранить термолабильные объекты – живые МО ( бакпрепараты ) и биологически активные вещества (ферментные препараты). Выбор режима сушки зависит от : температуры, конечной влажности материала и времени сушки.
По исходному агрегатному состоянию влаги : Сушка из жидкого состояния Испарение из твердого состояния, минуя жидкую фазу – сублимация. По способу подвода тепла: Контактная (плиты, вальцы) Конвективная Радиационная Диэлектический нагрев Комбинированные методы нагрева ( н-р, Сублимационные – Контактная+ Радиационная)
Тепло доставляется сушильным агентом (воздух, топочные газы, инертные газы), который играет роль теплоносителя и среды, в которую переходит влага из материала. Сушка во взвешенном или псевдоожиженном состоянии. Разновидности: Пневматические, Аэрофонтанные, Сушилки с кипящим слоем, Распылительные.
Сушка - секунды. Влажный материал рассеивается в поток нагретого воздуха (или другого газа), который при этом перемещает его по сушильному трубопроводу. Используя теплоту от воздушного потока, материал сушится по мере своего продвижения. Далее продукт отделяется с помощью циклонов. За ними следуют скрубберы или рукавные фильтры для окончательной очистки отработавших газов и удовлетворения существующих требований по ограничению выбросов. ПС могут обрабатывать самое разнообразное сырье – порошкообразное, гранулы, хлопья, пасты, гели и суспензии. При работе с суспензиями, пастами или липкими материалами требуется использование «обратного перемешивания», когда влажное сырье смешивается с частью сухого продукта, для доведения материала до кондиции, обеспечивающей оптимальную сушку.
Для повышения теплового КПД применяется повторное использование отработавших газов – рециркуляция. Рециркуляция может применяться во всех системах сушки, использующих входящий воздушный поток.
При АФС – поток теплоносителя уносит легкие высушенные частицы, а более тяжелые продолжают циркулировать в зоне сушки. Высушиваемый во взвешенном состоянии материал подвергается интенсивному перемешиванию. Благодаря вихревому движению теплоносителя несколько увеличивается время пребывания материала в зоне сушки.
Сушилка кипящего слоя для полидисперсных материалов содержит аппарат кипящего слоя в виде цилиндрического резервуара с коническим сужением внизу, под которым расположена дробилка.
Сушилки с кипящем слоем применяются для сушки различных мелкозернистых материалов. Внутри цилиндричесной камеры, на ступенчатых решетках находится в «кипящем» состоянии высушиваемый материал. Для поддержания равномерного «кипения» частиц в слое сушильный агент (воздух или топочные газы) подается под решетку равномерно и с соответствующей скоростью распределяется по всей ее площади. Подача влажного материала на решетку производится в верхней части сушильной камеры, а отбор высушенного материала осуществляется на уровне слоя материала в нижней части камеры.
При РС высушиваемый р-р или суспензия распыляются специальными устройствами в сушильной камере до мелкодисперсного состояния и смешивается с сушильным агентом. РС - метод, широко используемый для придания формы жидким продуктам. Для производства плотного порошка или жидких материалов, состоящих из частиц, таких как: раствор, эмульсия, суспензия и прессуемых веществ. Поскольку, размер частиц конечного продукта, остаточное содержание воды, плотность массы и форма частиц должны соответствовать точным стандартам, сушка распылением одна из наиболее выгодных технологий.
1. Отфильтрованный и нагретый воздух попадает в воздухораспределитель на верху сушилки. 2. Горячий воздух равномерно поступает в сушильную камеру. 3. Проходя через распылитель, жидкое вещество движется вращательно-поступательным образом, и разбрызгивается однородными каплями. 4. На протяжении очень малого времени при контакте с нагретым воздухом, вещества могут быть высушены для получения конечного продукта. 5. Конечные продукты непрерывно выгружаются со дна сушки и из циклонного фильтра. 6. Отработанные газы выгружаются из вентилятора.
«Мягкий» режим (Время сушки 15-30 секунд) Можно вести в асептических условиях Качественные показатели готового продукта (плотность, размер частиц, влажность, Т) можно регулировать и изменять. Готовый продукт не требует дальнейшего помола и обладает хорошей растворимостью Высокая производительность и несложность в обслуживании.
Сублимация или возгонка - влага из твердой фазы — льда переходит в газообразную — пар, минуя жидкую.
СС ведут при низкой температуре и при высоком вакууме. В таких условиях из продукта интенсивно испаряется влага, благодаря чему его температура снижается до минус 5 °С и ниже, т. е. происходит его самозамораживание. Подготовленный продукт загружают в сублимационную камеру, камера соединена с высокопроизводительным вакуум-насосом, который создает в ней высокое разрежение порядка 133—400 Па. Воздух, удаляемый из камеры, осушается в конденсаторе-вымораживателе, в который вмонтирован испаритель-рефрижератор холодильной установки. Давление пара в вымораживателе всегда ниже, чем в камере, благодаря чему высушивание продукта происходит достаточно быстро. Продукты СС имеют влажность около 4—6 %, в некоторых случаях ее можно довести до 2 %.
Среды высушивания (защитные среды) – криопротекторы : декстран, желатин, пептон, глютамат, трис-буфер, глицерин, ДМСО.
В продукте отмечаются лишь незначительные изменения химического состава, в нем хорошо сохраняются витамины, летучие ароматические вещества, цвет.
Способ сублимационной сушки применяют для консервирования таких биологических препаратов, как антибиотики, бактериальные удобрения, плазма крови.
Распылительная сублимационная сушка это относительно новый метод производства биофармацевтических порошков. РС - распыление жидкого раствора или суспензии в облако мелких капелек с тем, чтобы быстро испарить растворитель и сформировать частицы, устоявшийся метод производства стабильных белковых порошков. Недостатки: белки могут инактивироваться в процессе обработки в связи с адсорбцией и денатурацией на границе соприкосновения воздуха с жидкостью, а также под воздействием тепла при испарении!
Распылительная сублимационная сушка обычно включает: 1) распыление жидкого раствора или суспензии с использованием одножидкостных, пневмо - или ультразвуковых распылителей для формирования капелек 2) быстрое замораживание этих капелек в криогенном газе или жидкости 3) сублимация замороженной воды с последующим получением конечных сухих частичек.
Различного рода модификации необходимы в тех случаях, когда в результате процесса получается лишь "заготовка" целевого продукта. Так, например, пенициллин модифицируется до полусинтетических препаратов, поступающих для практического использования как коммерческие препараты. Модификация является необходимым этапом при получении многих ферментов, гормонов и препаратов медицинского назначения. МОДИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ
СТАБИЛИЗАЦИЯ ПРОДУКТА Для сохранения требуемых свойств получаемых продуктов в процессе их хранения, реализации и использования потребителями применяют различного рода физико-химические воздействия с целью повышения их стабильности. Показано, что определенная степень обезвоживания существенно повышает стабильность активностей ферментов, включая и устойчивость к нагреваниям. Стабилизация ферментов также достигается добавлением к препаратам глицерина или углеводов, которые формируют многочисленные водородные связи с аминокислотными остатками, препятствуя тем самым их денатурированию при нагревании или спонтанной инактивации.
Для стабилизации свойств БТ продуктов используют различные наполнители: отруби, кукурузная мука, неорганические ионы кобальта, натрия, магния, антибиотики, консерванты и активаторы.
В некоторых случаях стабилизация продукта представляет собой задачу особого биотехнологического процесса, а не только простой физико-химической модификации. В качестве примера можно привести стабилизацию пищевого продукта, получаемого из яичных желтков - меланжа, свойства которого при хранении существенно изменяются, что делает его непригодным к использованию. Однако порчу меланжа можно предотвратить, если удалить из него углеводы посредством выращивания на меланже пропионовокислых бактерий. Бактерии "выедают" углеводы, повышают питательную ценность продукта за счет обогащения органическими кислотами и витаминами, а также значительно удлиняют сроки хранения меланжа.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Биотехнология: теория и практика / Н.В. Загоскина и др. ; под ред. Н.В. Загоскиной, Л.В. Назаренко. – М.: «Оникс», 2009. – 496 с. – ISBN 978-5-488-02173 2. Клунова, С.М. Биотехнология: учебник / С.М. Клунова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. –М.: Академия, 2010. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-6697 3. Сазыкин, Ю.О. Биотехнология / Ю.О. Сазыкин, С.Н. Орехов, И.И. Чакалева ; - М.: Академия, 2008. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-5506-02. 4. Биотехнология: учебное пособие для вузов, в 8 кн., под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М., 1987. 5.Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. – М.: КолосС, 2004. – 296 с. – ISBN 5-9532-0231-8 (« КолосС »); ISBN 5-98109-008-1 (АНО «Химия»)
