Методы выделения, концентрирования и очистки биопрепаратов, методы высушивания 1
Содержание 1. Введение. 2. Подходы к выбору методов выделения и концентрирования микроорганизмов и продуктов микробного синтеза. 3. Основные методы выделения и концентрирования, преимущества и недостатки. 4. Консервирование биопрепаратов. 4. Заключение. 2
Литература 3 1. Загоскина Н. В., Назаренко Л. В., Калашникова Е. А., Живухина Е. А. Биотехнология. Теория и практика; Оникс - Москва, 2009. - 496 c. 2.. Клунова С. М., Егорова Т. А., Живухина Е. А. Биотехнология; Академия - Москва, 2010. - 256 c. 3. Под редакцией Воронина Е. С. Биотехнология; ГИОРД -, 2008. - 704 c
Конечным продуктом стадии ферментации является культуральная жидкость ‒ суспензия микроорганизмов, содержащая накопленный продукт микробиологического синтеза. Целевым продуктом микробиологического синтеза может быть: сама биомасса микроорганизмов (инактивированная или живые клетки) продукты метаболизма (антибиотики, ферменты, витамины и т.п.), растворенные в культуральной жидкости или находящиеся внутри клеток. Эндометаболит − целевой продукт находится внутри клетки (накапливается или входит в состав клеточных структур или оболочки) Экзометаболит − целевой продукт выделяется клеткой в КЖ
Выбор технологии выделения продуктов (метаболитов) зависит от места основного накопления продукта: – в культуральной жидкости - используются такие методы, как экстракция, ионный обмен, адсорбция, кристаллизация – внутриклеточно - используют экстракцию, -или выделяют целевой продукт после дезинтеграции (разрушения) клеточной стенки
При выборе метода концентрирования и выделения микроорганизмов и продуктов микробного синтеза необходимо учитывать следующие факторы: - Физико-химические свойства культуральной жидкости; - Свойства выделяемого продукта (термолабиль-ность, стойкость к различным химическим элементам и др); - Требования к конечной форме продукта (общая и биологическая концентрация, лекарственная форма, степень чистоты и степень концентрирования); - Технологические и технико-экономические показатели (выход продукта, производительность оборудования, необходимость дальнейшей обработки продукта и т.д.). 4
I. Если целевой продукт в виде твердой фазы: Осаждение. 2. Флотирование. 3. Фильтрование (микрофильтрация, ультрафильтрация). 4. Центрифугирование. 5. Сепарирование. II. Если целевой продукт в растворенном виде: Экстракция. Адсорбция. Кристаллизация. Диализ (обратный осмос). Упаривание. Методы выделения микроорганизмов и продуктов микробного синтеза из КЖ 5
Осаждение (седиментация) - это процесс, при котором при добавлении некоторых реагентов или при изменении физико-химических свойств КЖ, происходит расслоение дисперсных систем под действием силы тяжести и отделение дисперсной фазы в виде нерастворимого осадка. 6
Отстаивание применяют в следующих случаях: при диаметре частиц более 3 мкм (броуновское движение не оказывает существенного влияния на процесс отставания); при выделении стабильных продуктов (фактор времени не имеет решающего значения); когда необходимо разделить частицы на фракции по размеру или плотности на основании их различных скоростей осаждения; если необходимо предварительно разделить суспензию на две фракции: осадок и надосадочную жидкость, которые в дальнейшем можно обрабатывать на различном оборудовании. 8
Коагулянты - это вещества, переводящие взвешенные частицы в агрегатно неустойчивое состояние: желатин, рыбный клей, казеин, органические полиэлектролиты и др. Коагуляция – это процесс образования агрегатов частиц при изменении их электрических свойств под влиянием электролитов. Флокуляция – это процесс агрегации частиц (белков) под влиянием поверхностно-активных веществ (ПАВ), которые гидрофобизируют поверхность твердой фазы. Флокулянты - это вещества, способствующие разрушению коллоидных структур и образованию крупных хлопьев: неорганические вещества (активная кремниевая кислота, квасцы, соли железа и кальция), природные полимеры (крахмал, декстран, метилцеллюлоза, пектин и др.), синтетические полимеры (полиэтиленоксид, полистиролсульфокислота и др.). 9
Методы осаждения отстаивание коагуляция флокуляция высаливание осаждение органическими растворителями осаждение высокомолекуляр-ными полимерами осаждение ионами металлов применение носителей 7
Флотирование – это метод выделения и концентрирования твердой фазы путем вспенивания культуральной жидкости воздухом, при котором взвешенный в КЖ биологический материал (микроорганизмы) адсорбируются на поверхности раздела фаз «воздух – жидкость» и всплывают вместе с пузырьками воздуха 10
схемы пенных (пневматических) флотаторов: 1 - корпус; 2, 5 - аэраторы; 3 - штуцер для отвода отработанной жидкости; 4 - штуцер для отвода концентрата
Схема флотатора 1 – штуцер для выхода сгущенной суспензии. 2 – механический пеногаситель. 3 – корпус. 4 – труба подачи воды. 5 – внутренний стакан. 6 – штуцер для ввода дрожжевой суспензии. 7 – штуцер для вывода осветленной жидкости. 11
Схемы электрофлотаторов: 1- камера; 2, 3 - электроды; 4 - ввод культуральной жидкости; 5 - вывод отработанной жидкости; 6 - отвод концентрата; 7 - пеносъемник
Схемы струйных флотаторов: 1- корпус; 2 - трубы; 3 - газовый патрубок; 4 - штуцер входа газа; 5 - штуцер вывода отработанной жидкости; 6 - штуцер вывода концентрата; 7 - штуцер ввода суспензии; 8,1 0 - аэраторы
Фильтрование – это процесс разделения твердой и жидкой фаз КЖ при пропускании ее через пористую перегородку - полупроницаемую мембрану. На процесс фильтрования влияют: 1. Макрофакторы - разность давлений, толщина слоя осадка, вязкость жидкой фазы и др. (контролируются с помощью приборов). 2. Микрофакторы - размер и форма частиц осадка и пор фильтровальной перегородки, толщина двойного электрического слоя на поверхности частиц и т.п. (мало изучены, оказывают решающее влияние на процесс фильтрования и затрудняют его масштабирование). Мембрана - это высокопористая плоская или трубчатая перего-родка, изготовленная из полимерных или неорганических матери-алов, и способная эффективно разделять частицы различных видов (ионы, молекулы, макромолекулы и коллоидные частицы), находящиеся в смеси или в растворе. 12
Напорная (тупиковая) фильтрация
Фильтрация с необратимым забиванием фильтра 14
Фильтрация в поперечном потоке (кросс-флоу)
Фильтрация с поперечным потоком клеточной суспензии 15
Расходные материалы для фильтрации в поперечном потоке Кассета 137х 50 мм толщиной 10 мм 0,02 м2 137х127 мм толщиной 9 мм 0,1 м 2 210х175 мм толщиной 18 мм 0,6/0,7 м 2 Содержит пакет попарно параллельно расположенных полимерных мембран, между которыми проходит дренажный сетчатый слой. Поперечное течение фильтруемой среды к поверхности фильтра, возможность "обратной" промывки и изменения направления входного потока обеспечивают его долгий срок службы.
Схема плоскорамного фильтрующего элемента (кассеты)
Рулонные фильтрующие элементы
от 6 до 32 рулонных фильтров из полиэфирсульфона общая площадь фильтрации от 30 до 160 м 2 от 750 до 12.000 л/ч Установка Sartoflow 2000 с рулонными мембранными элементами
Обратный осмос Классификация мембранных методов в зависимости от размеров фильтруемых частиц и размеров пор в мембранах Ионы Молекулы Частицы 1 нм 10 2 нм 10 4 нм Ультра-фильтрация Микро-фильтрация Фильтрация 1 нм 10 2 нм 10 4 нм 13
Ультрафильтрация – это процесс при котором частицы, имеющие значительно больший размер, чем частицы растворителя, при пропускании раствора под давлением через трубчатую мембрану с малым размером пор задерживаются на внешней стороне мембраны. Эффект ультрафильтрации обусловлен: 1. Первичная адсорбция, когда вещество адсорби-руется на поверхности фильтра и его порах. 2. Блокировка, когда вещество удерживается внутри пор, либо выходит из них. 3. Просеивание – вещество механически удержи-вается на поверхности фильтрующего элемента (волокна). 16
17
18
Сборник Фильтрат Мембранный каркас Концентрат Мембрана Уплотнительные кольца Резьбовое подключение Направление потока Трубчатые фильтрующие элементы
УСТАНОВКА УЛЬТРА - И МИКРОФИЛЬТРАЦИИ С ТРУБЧАТЫМИ ЭЛЕМЕНТАМИ
Достоинства фильтрования 1. Концентрирование и очистка осуществляются без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений материала. 2. Перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям. 3. Механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно. 4. Легко обеспечиваются герметичность и асептические условия. 5. Аппаратурное оформление просто по конструкции, компактно, отсутствуют движущиеся детали. 6. Процесс не обладает высокой энергоемкостью, в большинстве случаев энергия затрачивается только на перекачивание растворов. Недостатки 1. Некоторые материалы, из которых изготовляются мембраны, не выдерживают очень высоких и очень низких значений рН или высоких температур, быстро изнашиваются. 2. Возникают определенные трудности при обработке растворов, содержащих твердую фазу. 19
Центрифуга представляет собой отстойник, который вращается вокруг центральной оси. При высокой скорости вращения действие силы тяжести заменяется регулируемой центробежной силой, что гарантирует лучшее качество процесса при разделении нескольких жидкостей или жидкости и твёрдых веществ. В данном случае процесс разделения высокоэффективен, точен и прост в обслуживании. Центрифугирование - это разделение неоднородных систем под воздействием центробежных сил
Классификация центрифуг по принципу разделения фильтрующие осадительные комбинированные Фильтрующие центрифуги применяют для глубокого обезвоживания и высокой степени промывки и отжима осадка. Осадительные центрифуги применяют для разделения суспензий. Классификация центрифуг по способу выгрузки осадка с выталкивающим поршнем с ручной выгрузкой инерционной контейнерной ножевой гравитационной гидравлической механико - пневматической с пульсирующим поршнем 21
Вертикальная центрифуга с верхней выгрузкой
Горизонтальная ножевая центрифуга
Высокоскоростная рефрижераторная напольная центрифуга среднего класса серии ЦРС-8 22
Центрифуга большого объема (6,4 л) с охлаждением и микро-процессором 23
Суперцентрифуга типа ОТР и РТР (скорость вращения ротора от 8000 до 9000 об/мин-1) 24
Области применения центрифугирования: выделение биомассы из КЖ; отделение различных целевых продуктов микробного синтеза (антибиотики, ферменты, витамины и т.п.), переведенных предварительно в твердую фазу; разделение жидкостей, образующихся при экстракции. Достоинства центрифугирования: высокая производительность; высокая степень концентрирования. Недостатки центрифугирования: сложность конструкции, высокая энергоемкость и стоимость; сложность эксплуатации (ненадежность, вибрация, необходимость периодической разборки и мойки); воздействие на клетку центробежной силы и нагревания; трудность герметизации и обеспечения асептических условий процесса выделения. 20
Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее, чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.
Отвод твёрдых веществ (взвесей) (1) непрерывный (2) периодический (3) ручной
Центрифуга-сепаратор Alfa Laval DMRPX 207 25
Классификация сепараторов по технологическому назначению Сепараторы-разделители применяемые для выделения жидкостей, не растворимых одна в другой, и для концентрирования суспензий и эмульсий Сепараторы-осветлители предназначенные для выделения твердых частиц (в том числе и клеток) из жидкости Комбинированные сепараторы предназначенные для выполнения двух и более операций переработки жидкой смеси 26
Экстрактор–сепаратор «Сибирь» 27
Высокоскоростная бактофуга АХ-213 фирмы «Альфа-Лаваль»: 1 – трубка для подачи жидкости на осветление; 2 – барабан; 3 – карманы для твердых частиц; 4 – напорный диск; 5 – уплотнение; 6 – сопла для выгрузки твердых частиц; 7 – тарелки; 8 – корпус рабочего вала; 9 – масленки; 10 – амортизатор; 11 – магнитная муфта; 12 – электродвигатель; 13 – основание. 28
Важными факторами при выборе технологии сепарирования являются: Тип продукта ( внутриклеточный,внеклеточный или включенное тело), Характеристики каждого отдельного организма (бактерия, дрожжи, мицелла и т.д.), Требуемая скорость потока, Необходимость абсолютной стерильности, Полная герметичность.
Преимущества и недостатки сепараторов Центробежные сепараторы обладают рядом преимуществ : · высокая производительность; · хорошая степень концентрирования, достигается концентрация биомассы 5-15 % по сухой массе; · возможность повышения скорости сепарирования предварительной обработкой жидкости флокулянтами. При этом в использовании сепараторов есть и недостатки : · сложность оборудования; · энергоемкость процесса. Таким образом, с экономической точки зрения сепарирование как метод выделения и очистки биотехнологических продуктов менее выгоден, чем, например, фильтрация и оправдывает себя, если: · суспензия фильтруется медленно; · необходимо максимальное освобождение культуральной жидкости от содержащихся частиц; · необходим непрерывный процесс сепарации в условиях, когда фильтры рассчитаны только на периодическое действие.
Экстракция - процесс разделения смеси твердых и жидких веществ с помощью избирательных (селективных) раствори-телей (экстрагентов). Экстракция твердо-жидкофазная жидкофазная Преимущества метода 1. Низкие затраты. 2. Высокая скорость экстракционных процессов. Недостаток Использование вредных, взрывоопасных органических веществ. 29
Адсорбция (ионообмен) – это процесс поглощения целевого продукта из газовой смеси или раствора твердым веществом - адсорбентом. Наиболее широко применяемые сорбенты: активированные угли; окись алюминия; глина; органические и неорганические иониты; синтетические ионообменные смолы (КУ-2, КБ-4, КБ-4П-2, КМД, АВ-17 и др). 30
Кристаллизация - это процесс выделения целевого продукта из раствора в виде кристаллов в результате изменения его физико-химических свойств, путем перевода продукта в нерастворимую химическую форму методом изменения рН раствора или добавлением определенного реагента с одновременным снижением температуры Диализ (обратный осмос) является мембранным методом концентрирования растворов путем удаления воды Упаривание – это процесс концентрирования растворов путем частичнго удаления растворителя испарением при нагревании жидкости 31
Диализатор 1 – внутренний сосуд; 2 – полупроницаемая мембрана; 3 – внешний сосуд 32
Методы консервирования биопрепаратов консервирование при положительных температурах с помощью химических соединений (хлороформ, фенол, глицерин, формалин и др) консервирование при низких температурах (замораживание) консервирование высушиванием 33
Методы высушивания сублимационный конвективный контактный терморадиа-ционный токами высо-кой частоты комбиниро-ванный 34
Лиофильное высушивание – это метод консервирования биопрепаратов, при кото-ром высушивающими агентами являются температура и отрицательное давление (вакуум). Сущность метода состоит в том, что вода из замороженного препарата испаряется, минуя жидкую фазу, в условиях глубокого вакуума. 35
36
Сублимационная сушка со схемой 37
Лиофильная сушка Martin Christ Alpha 2-4 LSCplus 38
Лиофильная сушка Martin Christ 39
Сублимационная установка ilShin LP10R 40
Лабораторные лиофильные сушки ScanVac CoolSafe Pro Superior X 41
Установка для лиофильной сушки на Щелковском биокомбинате 42
Лиофильная установка Heto, компании Миллаб 43
Схема лиофильного высушивания вакцин и сывороток 44
Требования, предъявляемые к средам высушивания атоксичность; отсутствие антигенных свойств; наличие адьювантных свойств (в случае изготовления вакцин); компоненты среды должны служить структурирующим (опорным) материалом; среда должна ингибировать гидролитичес-кие ферменты; среда должна обладать антиокислительной активностью. 45
Подготовка ампул для высушивания биопрепарата 46
47
48
Сублимационное высушивание биопрепаратов 49
Запаивание ампул 50
Характерные признаки, свидетельствующие о неправильном лиофильном высушивании биопрепарата: появление пузырьков на поверхности материала, как результат наличия в замороженной массе некоторого количества жидкости; крупная неравномерная пористость; неравномерная окраска; значительное сокращение объема по сравнению с исходным; плохое отставание сухой массы от стенок ампулы или флакона; плохая растворимость высушенного материала. 51
Технологическая линия производства биопрепаратов (Покровский НИИВВиМ) 52
Конвективное высушивание – это метод консервирования биопрепаратов, при котором высушивающим агентом является нагретый воздух. Сущность метода заключается в том, что сушильный агент передает тепло материалу, под действием которого из материала удаляется влага в виде пара, поступающая в окружающую среду. Таким образом, сушильный агент является одновременно и теплоносителем и влагопоглотителем. 53
Схема сушилки с «кипящим слоем» 1- сушильная камера; 2- газовод; 3, 8- колориферы; 4, 9- вентилято-ры; 5- гранулятор; 6, 10- циклоны; 7- сетки. 54
Сушилка с «кипящим слоем» 55
56
Распылительная сушилка FSD-4 57
Преимущества распылительного высушивания: кратковременность воздействия температуры; можно изменять некоторые показатели получаемых порошков: размер частиц, влажность, насыпную массу; готовый продукт не требует дальнейшего измельчения; обеспечивается высокая чистота продукта; распылительные сушилки высокопроизводительны и несложны в обслуживании. Недостатки распылительного высушивания: большие габариты распылительной сушильной установки; значительные потери вегетативных бактерий при обезвоживании биологических растворов; высокая стоимость оборудования, в частности распылителей; высокий расход электроэнергии; необходимость использования специального оборудования (фильтров) для тонкой очистки отходящих газов. 58
Контактный метод высушивания – это метод консервирования биопрепаратов, при котором высушивающим агентом является нагретая поверхность. Сущность метода состоит в том, что биоматериал, соприкасаясь с горячей поверхностью, нагревается и происходит испарение влаги. 59
Терморадиационный метод высушивания – это метод консервирования биопрепаратов, при котором высушивающим агентом являются инфракрасные лучи. Сущность метода состоит в том, что тепло материалу передается за счет невидимых инфракрасных лучей с длинной волны 0,77...340 мкм, которые обладают высокой проникающей способностью и с высокой скоростью нагревают материал. 60
Сушка токами высокой частоты – это метод консервирования биопрепаратов, при котором высушивающим агентом являются токи, с частотой колебания от 10 до 3000 Мгц. Сущность метода состоит в том, что органический материал помещается между обкладками конденсатора, к которым подается электрический ток высокой частоты, при этом продукты биологического происхождения, представляющие собой диэлектрики, имеющие некоторую проводимость и обладающие свойствами полупроводников, под действием переменного электрического поля высокой частоты быстро и равномерно нагреваются. 61
Заключение 1. При выборе метода концентрирования и выделения биологического материала необходимо учитывать свойства КЖ, свойства выделяемого продукта, требования к конечной форме продукта, технологические и технико-экономические показатели. 2. Если выделяемое вещество в КЖ находится в твердой фазе, используют такие методы выделения и концентрирования, как осаждение, фильтрование, центрифугирование, сепарирование, а если в растворе - экстракция, адсорбция, кристаллизация, диализ, упаривание. 3. Сушка – это сложный технологический процесс, который часто является решающим этапом производства биопрепаратов. 62
Благодарю за внимание !!! 63
