ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Цитологические методы Экспресс методы Вирусологический метод Серологический метод
Цитологические методы Исследуются материалы аутопсии, биопсии, мазки, которые после соответствующей обработки окрашиваются и анализируются под микроскопом. цитомегаловирусная инфекция (семейство герпесвирусы ) - в срезах ткани или в моче обнаруживаются характерные гигантские клетки- «совины е глаза» вирус бешенства (семейство рабдовирусы ) - включения в цитоплазме клеток (тельца Бабеша-Негри ). «совиные глаза»
Тельца Бабеша-Негри в окрашенных гистологических срезах, мазках или отпечатках мозга обнаруживаются в цитоплазме нервных клеток в виде округлых, овальных, сферических, амебовидных или веретенообразных включений. Хорошо видимые под световым микроскопом тельца Бабеша-Негри состоят из гомогенной основной субстанции, содержащей зерна, и отделены от цитоплазмы клетки неокрашенным, светлым ободком. Зерен величиной от 0,2 до 1 мкм может быть 1-15.
ЭКСПРЕСС МЕТОД Ы Обнаружение вирусного АГ или НК в исследуемом (клиническом материале) с помощью: РИФ ИФА РИА ПЦР Метод электронной микроскопии и иммунной электронной микроскопии
РИФ - Реакция иммунофлюоресценции Метод основан на использовании антител, связанных с красителем. применяется для быстрой расшифровки этиологии острых респираторных вирусных инфекций. требует содержания в клиническом материале достаточно большого числа инфицированных клеток. ИФА - Иммуноферментный анализ Метод основан на мечении антител ферментами позволяет измерять растворимые антигены. могут использоваться различные виды клинического материала.
РИА - Радиоиммунный анализ Метод основан на метке антител радиоизотопами,. высокая чувствительность в определении вирусного антигена. недостаток - работа с радиоактивными веществами и использование дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков). метод ПЦР - полимеразной цепной реакции Метод заключается в многократном повторении циклов синтеза (амплификации) вирусспецифической последовательности ДНК. В основе – способность вирусной ДНК гибридизироваться с меченой комплементарной ДНК. позволяет обнаружить несколько копий вирусной ДНК в исследуемом материале.
С помощью этого метода можно обнаружить собственно вирус. Для успешного определения вируса необходима его высокая концентрация в пробе ( ~ миллион частиц/мл)
РЕАКЦИЯ ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ВИРУСОВ Интерференция вирусов – состояние невосприимчивости к вторичному заражению клетки, уже инфицированной вирусом. Инфицирование одним вирусом полностью блокирует возможность репликации второго вируса в пределах одной клетки. При индикации можно внести в культуру клеток дополнительный лабораторный штамм вируса, вызывающий характерное ЦПД. После этого ЦПД проявиться только в случае отсутствия первоначального внесенного вируса в исследуемом материале.
ИНДИКАЦИЯ ВИРУСОВ ПО ЦВЕТНОЙ ПРОБЕ Внешний вид цветной пробы для индикации вирусов в исследуемом материале: в образцах 1 и 2 – цветная проба отрицательна, т.е. вирус отсутствует в исследуемом материале. в образце 3 – цветная проба положительна, т.е. индикатор показывает щелочную реакцию среды, означающую гибель клеточной культуры из-за репликации вируса
Реакция гемагглютинации (РГА)
В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном - эритроциты оседают в виде пуговки или колечка.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
РСК для идентификации вируса Комплемент – сложная система сывороточных протеинов. Нестоек, разрушается при 55 градусах в течение 30 минут. При комнатной температуре комплемент разрушается в течение 2-х часов. Очень чувствителен к продолжительному встряхиванию, к действию кислот и ультрафиолетовых лучей. Но длительно (до шести месяцев) сохраняется в высушенном состоянии при низкой температуре. Комплемент адсорбируется только на комплексе «антитело – антиген».
Если образуется комплекс «антитело – антиген», адсорбирующий на себе комплемент, реакция связывания комплемента положительна и лизис эритроцитов в гемолитической (индикаторной) системе не произойдет. Если комплекс «антиген – антитело» не образуется, то реакция связывания комплемента отрицательная, комплемент остается свободным, и при добавлении гемолитической системы наступает лизис эритроцитов.
А - цитопатогенное действие (ЦПД) в результате размножения вирусов; Б - ЦПД отсутствует в результате предварительной нейтрализации вирусов антителами. Реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток
ФИТЦ ( изотиоцианат флуоресцеина ) (зеленое свечение) сульфохлорид родамина (красное свечение)
III. СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД (СЕРОДИАГНОСТИКА) Реакции антигенов с антителами называются серологическими или гуморальными, т.к. участвующие в них специфические антитела всегда находятся в сыворотке крови. Эти реакции могут быть воспроизведены в лабораторных условиях с диагностической целью.
серотипирование (сероидентификация) антигена в целом с помощью известного антитела ( иммунной диагностической сыворотки ). серодиагностика - определение природы антитела в сыворотке крови больного при вирусных, реже других инфекционных заболеваниях с помощью известного антигена ( диагностикума ). Иммунные диагностические сыворотки - препараты, содержащие известные антитела для определения родовой, видовой и типовой принадлежности антигена. Диагностикумы - препараты, содержащие известный антиген в виде взвеси живых или убитых бактерий, продуктов их расщепления, токсины, вирусы.
