ЗАНЯТИЕ 6
Ознакомить студентов с особенностями культивирования вирусов в эмбрионах кур, схемой эмбрионов кур и методами заражения эмбрионов кур.
- подготовленный для работы бокс; - 7-9 суточные куриные эмбрионы; - набор стерильных хирургических инструментов - пинцет, ножницы, скальпель в стаканчике со спиртом; - одноразовые шприцы на 1 мл; - пипетки с парафином; - вируссодержащий материал в пробирке; - спиртовки; - йодированный спирт для дезинфекции скорлупы; - ватный квачик в пустой пробирке для обжигания скорлупы.
В последнее время очень часто для культивирования вирусов применяют куриные эмбрионы (КЭ). Они имеет ряд преимуществ перед лабораторными животными: Куриные эмбрионы дешевле лабораторных животных (яйцо в два - три раза дешевле белой мыши). Не требуется затрат на содержание. Легко фиксировать, проще работать.
Куриные эмбрионы в большинстве случаев свободны от возбудителей спонтанных, скрытых вирусных заболеваний КЭ и в вирусологических лабораториях применяется с целью: Выделения вируса из исследуемого материала. Накопления вируса путем пассажа. Проведения серодиагностики. Получения живых и убитых эмбрион - вакцин. Изучения свойств вирусов.
Свежее племенное яйцо для КЭ желательно отбирать крупное с непигментированной скорлупой (лучше от кур породы Леггорн ), от крупного эмбриона можно больше собрать вируссодержащего материала и в нем хорошо видны при овоскопии эмбрион и пуга. Кроме того эмбрионы породы Леггорн легко заражаются и неприхотливы к условиям инкубации. Инкубацию производят при температуре +37°С - +38°С и относительной влажности 40-50% и яйца переворачивают 2-3 раза в день.
Зародыш формируется в яйце еще в утробе курицы. В 1-2 дня инкубации закладывается головной и спинной мозг, а также скелетная мускулатура. На 2-ой день закладывается сердце, кровеносные сосуды, нервы, а в дальнейшем половые железы. На 5-ый день бурно развивается головной мозг, появляются пигменты зрачка. На 8-е сутки эмбрион уже похож на цыпленка. На 9-10 сутки появляется пушок, а на 13-е сутки пух и ясные контуры цыпленка.
Под скорлупой находится перепончатая или подскорлуповая оболочка, которая у тупого конца раздваивается - один слой идет под скорлупой, окаймляя пугу (воздушную камеру), а другой над белком. Примерно в центре развивается эмбрион. Последний окружен аминионом, с противоположной стороны от аминиона находится желточная полость (мешок). С 3-го дня начинает развиваться аллантоисная полость, где скапливаются продукты обмена КЭ, он огибает желток, распространяется к тупому концу, огибает зародыш и срастается с хорионом, располагающемся под скорлуповой оболочкой и образуется хорионаллантоисная оболочка. В остром конце яйца будет остаток белка, а в тупом пуга. Через хорионаллантоисную оболочку осуществляется газообмен. Желток является главным резервуаром питательных веществ для зародыша. В аллантоис в первые дни выделяются продукты обмена веществ эмбриона, а по мере рассасывания белка аллантоис является поставщиком воды и минеральных веществ. Амнион служит буферной камерой для эмбриона. По мере роста и развития эмбриона объем желтка и белка уменьшается, а аллантоисная и амниотическая полость увеличивается.
Для заражения используют эмбрионы в возрасте 7-12 суток. Раньше 7 дней эмбрионы мелкие и плохо проводить заражение, а старше 12 дней КЭ не рекомендуется использовать, во- первых, потому что жидкость полостей мутнеет и при хранении ее соли оседают в виде хлопьев, на которых также может адсорбироваться вирус. Во- вторых, на коже эмбриона появляется пушок, на котором также может адсорбироваться вирус.
Важным условием при работе с КЭ является соблюдение асептики. Необходимо предотвратить попадание в яйцо микробов. Если микробы попадут в яйцо, то они быстрее разовьются, чем вирус, и эмбрион может погибнуть еще до накопления вируса. Поэтому необходимо соблюдать следующие правила: В лаборатории должны быть бокс с бактерицидными лампами и ионизатор, перед работой с КЭ бокс следует подвергать обработке этими лампами в течение 2-3 часов. Пользоваться только стерильными инструментами. Работа в боксе проводится в халатах, головных уборах. Строго соблюдать правила предварительной обработки скорлупы.
Перед заражением необходимо убедиться в жизнеспособности эмбриона. Для этого в затемненной комнате проводят овоскопию. Если эмбрион жив, то он будет смещаться, сокращаться. Можно различить туловище, глаза (темное пятно правильной округлой формы). Сосуды красные, хорошо наполненные кровью, иногда видна пульсация крупных сосудов. Если эмбрион погиб, то он не шевелится, мертвый эмбрион темнее, сосуды темные, эмбрион "болтается". При овоскопии отмечают простым карандашом контуры пути, а крестиком предлежание эмбриона - глазок.
Перед заражением КЭ скорлупа на месте вскрытия или инъекции обрабатывается спиртом, обжигается, затем обрабатывается 5% раствором йода и вновь обжигается. Можно обрабатывать йодированным спиртом. Только после этого делаем прокол или вскрытие скорлупы. Методов заражения КЭ много, основные из них следующие: Заражение на хорион-аллантоисную оболочку, заражение в аллантоисную полость, заражение в амниотическую полость, в желточный мешок.
КЭ должен быть 7-10 дневного возраста. На хорион-аллантоисной оболочке можно культивировать вирусы оспы, ящура. Доза заражения - 0,1 мл. Имеются три метода заражения на хорионаллантоисную оболочку: А. Со стороны пути. Ножницами вскрывают пугу, иглой или пинцетом отпрепаровываем второй листок подскорлуповой оболочки в месте хорошо развитых кровеносных сосудов, наносим вирусосодержащий материал и тем же листком прикрываем. Окошечко в скорлупе закрывается покровным стеклом (или мелким часовым стеклом) и заливаем парафином. Б. На границе пуги выпиливается скорлупа - 5x5x5 мм, отпрепаровывается подскорлуповая оболочка, а затем все также как в пункте "а".
С. Окошечко делается сбоку против зародыша. В этом случае иногда надо делать противоотверстие со стороны пуги и с помощью груши отсасывать воздух Заражение на хорион- аллантоисную оболочку.
Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения - 0,1 мл. Можно культивировать вирус гриппа, чумы птиц, чумы собак, инфлуэнцы. Существует два способа. А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настолько, чтобы попасть в аллантоисную полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином. Б. Против предлежания К.Э. Яйцо фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 0,5 см. Отверстие закрываем парафином.
Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения - 0,1 мл. Существует два способа. А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настолько, чтобы попасть в амниотическую полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином. Б. Против предлежания К.Э. Яйцо фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 1,5 см. Отверстие закрываем парафином.
В этом случае используют 5-7 дневные эмбрионы. Доза заражения 0,5-1,0 мл. Применяют при орнитозе, пситтакозе, энцефалитах, риккетсиозах, бруцеллезе. Существует два способа. А. Яйцо фиксируется крестиком вниз, сверху в центре яйца делается прокол скорлупы и вводится игла на 1,5-2 см, чтобы попасть в желточный мешок. Отверстие закрывается парафином. Б. Яйцо оставляют в том же положении, прокол делают со стороны пути, иглу вводим с уклоном вверх, чтобы попасть в желточный мешок на 3-4 см. Отверстие закрывается парафином. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации при температуре +37°С - +38°С в процессе которой происходит культивирование вирусов.
Студенты знакомятся с методами заражения куриных эмбрионов. Студенты проводят овоскопию куриных эмбрионов. Студенты заражают куриные эмбрионы.
Для каких целей заражают курные эмбрионы? Каково преимущество заражения куриных эмбрионов? Каковы методы заражения куриных эмбрионов?
