Нуклеиновая кислота - высокомолекулярное органическое соединение, биополимер ( полинуклеотид ), образованный остатками нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты ДНК и РНК присутствуют в клетках всех живых организмов и выполняют важнейшие функции по хранению, передаче и реализации наследственной информации. Растительные ДНК (нуклеиновые кислоты)
Полимерные формы нуклеиновых кислот назы-вают полинуклеотидами. Цепочки из нуклеотидов соединяются через оста-ток фосфорной кислоты (фосфодиэфирная связь). Поскольку в нуклеотидах существует только два типа гетероциклических молекул, рибоза и дезоксирибоза, то и имеется лишь два вида нуклеиновых кислот — дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК). Фрагмент полимерной цепочки ДНК Мономерные формы также встречаются в клетках и играют важную роль в процессах передачи сигналов или запасании энергии. Наиболее известный мономер РНК — АТФ, аденозинтрифосфорная кислота, важнейший аккумулятор энергии в клетке.
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) Сахар — дезоксирибоза Азотистые основания: пуриновые — гуанин (G) и аденин (A) пиримидиновые — тимин (T) и цитозин (C) ДНК часто состоит из двух полинуклеотидных цепей, направленных антипараллельно. РНК (рибонуклеиновая кислота) Сахар — рибоза Азотистые основания : пуриновые — гуанин (G) и аденин (A) пиримидиновые — урацил (U) и цитозин (C). Молекулы РНК часто имеют различные вторичные и третичные структуры(из-за особенностей рибозы ), образуя компле-ментарные участки между разными цепями.
ЖИДКОФАЗНЫЕ МЕТОДЫ ТВЕРДОФАЗНЫЕ МЕТОДЫ Классические методы выделения Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно Метод выделения нуклеиновых кислот на стекле Метод на основе магнитной сепарации Наборы для выделения и очистки нуклеиновых кислот
Гелеобразный осадок нуклеиновой кислоты Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНК используется фенол-хлороформная экстракция. При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней (водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе.
При этом используются сильные хаотропные агенты, такие как гуанидин тиоцианат и цезия трифлуороацетат для одновременного разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз ( РНКаз ). Лимитирующими факторами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования и большое время анализа (16–44 ч). гуанидин тиоцианат трифлуороацетат
Этот метод включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, и последующую сорбцию нуклеиновой кислоты на носителе (стеклянные бусы, и т.д.). Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин хлорида,гуанидин тиоцианата ). гуанидин хлорида гуанидин тиоцианат
Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР-реакцию, например полисахариды,фенольные компоненты, гумус. Для автоматического выделения нуклеиновых кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Express Magnetic Particle Processors - прибор для выделения нуклеиновых кислот на магнитных частицах
Электрофорез — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру и форме. Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. К образцам обычно добавляют низкомолекулярный кислый краситель, чтобы визуализировать ход электрофореза в процессе. Краситель также необходим для того, чтобы определить, когда стоит остановить процесс. После разделения фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.
электрофорез в полиакриламидном геле электрофорез в агарозном геле для относительно длинных молекул ДНК для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования
Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза. Левая дорожка — фрагменты ДНК известной длины Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длиной волны 312нм.
выбор исходного материала; разрушение клеток и экстракция; выделение исследуемого белка из смеси других белков, т.е. очистка и получение индивидуального белка.
лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическая солюбилизация, механическое, разрушение при котором используют лопастной гомогенизатор, с помощью пресса, ультразвука ручное шлифование с помощью ступки и пестика в жидком азоте замораживание /оттаивание,
Высаливание ( сульфат аммония) Осаждение органическими растворителями (ацетон, спирт)
Ультрацентрифугирование
Седафексы – это поперечно-сшитые декстраны с заданными размерами пор.
1) SDS-PAGE по Лэммли:
SDS-PAGE-gels
Изоэлектрическая точка – это значение рН, при котором суммарный заряд вещества равен нулю. Амфолиты – это соединения, обладающие как кислотными, так и основными свойствами.
