Сарсенова Е.А. Биолог НОЦ Молекулярных и клеточных технологий Санкт-Петербург 2020 г.
Электрофорез - разделение смесей биомолекул в электрическом поле П рименение
П рименение Метод используется для идентификации состава смеси ДНК или РНК
При пропускании электрического тока через раствор в нем формируется направленное электрическое поле Под действием поля молекулы начинают движение в направлении катода(-) или анода(+) ДНК – отрицательно заряженная молекула, будет двигаться к аноду Принцип метода
Движение молекул осуществляется в геле, пронизанном маленькими порами Чем молекулы меньше, тем легче им проходить через поры и тем быстрее они проходят через гель Принцип метода Чем молекулы ДНК объемистее, тем сложнее им бегать — все как у людей!
Через определённое время, электрический ток отключают и движение молекул прекращается К этому моменту молекулы распределятся в соответствии с их размерами Принцип метода
Состав геля Агароза – полисахарид получаемый из красных морских водорослей Porphyra umbilicalis Агарозу растворяют в буферном растворе, после чего нагревают для полного растворения Матрица из агарозы инертна Варьируя процентным содержанием агарозы в буфере, можно устанавливать необходимый объём пор. Маленький процент – большие поры Большой процент – маленькие поры
Буфер для электрофореза Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную или уксусную кислоту: TAE и TBE. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора. Tris -acetate-EDTA Tris -borate-EDTA TAE TBE
Бромид этидия Это интеркалирующий агент, который интеркалирует между основаниями нуклеиновых кислот и позволяет удобно обнаруживать фрагменты ДНК в геле. Под ультрафиолетовым светом образует оранжевое свечение. Бромид этидия вносят в пробы, в сам гель или окрашивают гель в конце анализа. * Интеркаляция — обратимое включение молекулы или группы между другими молекулами или группами.
Маркеры Маркеры длин ДНК предназначены для определения размера молекул, прошедших через гель
Краситель для проб Краситель смешивают с пробами и маркером длин ДНК для визуализации хода анализа В начале анализа необходимо убедиться, что краситель движется в нужном направлении Анализ следует остановить, когда краситель прошёл ¾ длины геля
Напряжение Общая скорость движения ДНК через агароз н ый гель зависит от напряжения Повышение напряжения приводит к повышению скорости Чрезмерно высокое напряжение нагревает гель, в результате чего он может растаять
Схема эксперимента
Возможные трудности Перед заливкой геля необходимо убедиться, что агароза полностью растворена Перед заливкой геля необходимо проверить раствор агарозы на отсутствие пузырьков При загрузке проб следить за тем, чтобы не было перекрёстного смешивания растворов в лунках Перед включением источника тока нужно проверить полностью ли погружен гель в буфер Необходимо отмечать в какой лунке, какая проба
Использование результатов анализа
Этапы ПЦР Выделение РНК Получение ДНК на матрице РНК Проведение ПЦР Визуализация результатов В результате ПЦР получается множество копий одного или нескольких фрагментов ДНК. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты (НК) пробе Гель-электрофорез в рамках данного курса
Для этого вам необходимо зарегистрироваться Указать email и придумать пароль (остальные графы можно не заполнять): Далее повторно перейти по ссылке в заголовке слайда и нажать « Login » Просмотрите демонстрацию анализа на сайте https://vlab.amrita.edu/index.php?sub=3&brch=77&sim=1375&cnt=2870 При появлении такой надписи: Необходимо выполнить следующее : Нажать на букву « i » рядом с адресной строкой Выбрать пункт «Настройки сайтов» Перейти к графе « Flash » Установить «Разрешить» Вернуться к сайту и обновить страницу
Самостоятельно проведите гель-электрофореза в виртуальной лаборатории: https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/
