Инструменты (часть 2). Полимеразная цепная реакция
Что такое хаотропный агент? Зачем они нужны? Примеры? Что есть экстракция? Как понять сколько ДНК в пробирке? Что делают рестриктазы ? Лигазы? Полимеразы?
Что такое хаотропный агент? Зачем они нужны? Примеры? Что есть экстракция? Как понять сколько ДНК в пробирке? Что делают рестриктазы ? Лигазы? Полимеразы?
Общие идеи организации генетического материала прокариот Escherichia coli - G- 1 – основная хромосома 2 – плазмиды Главное – это двуцепочная, кольцевая ДНК. Остальных деталей не так много.
Исключения в мире плазмид Боррелии Некоторые стрептомицеты РНК-плазмиды ???
Два варианта репликации плазмид Катящееся кольцо Тета-репликация
Копийность плазмид
Common Vectors Copy Number + ori Incompatibility Group Control pUC ~500-700 pMB1 (derivative) A Relaxed pBR322 ~15-20 pMB1 A Relaxed pET ~15-20 pBR322 A Relaxed pGEX ~15-20 pBR322 A Relaxed pColE1 ~15-20 ColE1 A Relaxed pR6K ~15-20 R6K* C Stringent pACYC ~10 p15A B Relaxed pSC101 ~5 pSC101 C Stringent pBluescript ~300-500 ColE1 (derivative) and F1** A Relaxed pGEM ~300-500 pUC and F1** A Relaxed Организация плазмид Ориджин Полилинкер ( MCS) Селективный маркер Можно выбирать любые(почти) сайты и разрезать по ним Нужно следить, что плазмида не потерялась Для разных целей нужны разные плазмиды
Плазмида – двуцепочная ДНК, реплицирующаяся отдельно от генома хозяина + обладающая большей мобильностью, чем геном Возможно эгоистична Плазмида Хозяин Размер плазмиды (тыс. пар оснований) Геометрия плазмиды Число копий плазмиды на клетку pUB110 Bacillus subtilis 2,3 Кольцевая 20—50 ColEl Escherichia coli 6,6 Кольцевая 10—30 lp25 Borrelia burgdorferi [en] 24,2 Линейная 1—2 pNOB8 Sulfolobus [en] sp.a ( архея) 41,2 Кольцевая 2—40 F Escherichia coli 99,2 Кольцевая 1—2 SCP1 Streptomyces coelicolor [en] 350,0 Линейная 4 pSymA Sinorhizobium meliloti 1354,2 Кольцевая 2—3 Плазмида Хозяин Размер плазмиды (тыс. пар оснований) Известная функция pT181 Staphylococcus aureus 4,4 Устойчивость к тетрациклину ColEl Escherichia coli 6,6 Образование колицина и устойчивость к нему pMBl Escherichia coli 8,5 Система рестрикции-модификации pAMpi Enterococcus faecalis [en] 26,0 Устойчивость к эритромицину pSK41 Staphylococcus aureus 46,4 Множественная устойчивость pBM4000 Bacillus megaterium 53,0 Оперон рРНК pI258 Staphylococcus aureus 28,0 Устойчивость к ионам тяжёлых металлов pSLT Salmonella enterica sv. Typhimurium 93,9 Детерминанта вирулентности pMT1 Yersinia pestis 101,0 Детерминанта вирулентности pADP-1 Pseudomonas sp. 108,8 Катаболизм атразина ( гербицид ) pWW0 Pseudomonas putida 117,0 Деградация ароматических углеводородов pX01 Bacillus anthracis 181,7 Синтез энтеротоксинов pSOL1 Clostridium acetobutylicum 192,0 Образование сольвента pSymB Sinorhizobium meliloti 1683,3 Множественные функции Организация плазмид
Перенос генетической информации. Зачем нужны плазмиды? Горизонтальный перенос обычное явление в мире прокариот, но вот с эукариотами сложнее. Возможно, это существует на уровне исключений
Из всей генетической информации часто нужен лишь небольшой участок Оперон - группа генов транскрибируемых и регулируемых вместе Длина конкретных генов будет от сотни до нескольких тысяч(редко десятков тысяч) нуклеотидов. Опероны могу быть несколько больше, но при этом часто дают целый биохимический путь Длина же даже небольших геномов прокариот исчисляется млн. нуклеотидов. Как получить в пробирке только тот участок, который нужен?
Репликация. Общее устройство клеточной машинерии Полимеразы – это лишь маленькая часть
ДНК – полимеразы ( репликативные ) У прокариот – полимераза III У эукариот – полимеразы α и δ Важные свойства – скорость и процессивность 3 ’-5’ Экзонуклеазная активность повышает точность работы полимеразы Полимеразная активность 3 ’-5’ Экзонуклеазная активность «Переходник» Зажимы, увеличивающие процессивность Загрузчики зажимов
Как ограничить репликацию В репликативной машинерии полимеразам всегда помогают праймазы A A A G T G G T T A T G C C C A A T C G G C T T T C A C C A A T T G G G A C C 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ А в эту сторону ничего не будет синтезироваться
5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ И в эту сторону ничего не будет синтезироваться В эту сторону ничего не будет синтезироваться Или будет?? Праймер комплементарен только одной цепи, на другую он не сядет Репликация идет на каждой цепи отдельно Как ограничить репликацию
5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ Надо развалить вновь синтезированную двухцепочную структуру Как ограничить репликацию
5’ 3’ 3’ 5’ Здесь она дальше не пойдет 5’ 3’ Снова денатурируем и запустим репликация (рассмотрим только нижний) Получился фрагмент строго ограниченный праймерами Тут еще есть хвост, но если еще раз денатурировать и « отполимеразить », то у нас будет еще один ограниченный ДНК фрагмент Как ограничить репликацию
А что с хвостатыми ДНК фрагментами? Исходная матрица
Ин витро полимеризация. Что нужно? Полимераза дидезоксинуклеотиды Буферная система Олигонуклеотиды ( праймеры ) ДНК-матрица Разбавить водой Объем??
Ин витро полимеризация. Устройство PCR 95-98 С 95-98 С 50-65 С 72С 72С 1-5 мин 15-30 сек 10-20 сек 15-600+ сек 5 мин 25-40 циклов
Дизайн праймеров Температура отжига зависит от длины: Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4 Tm= (wA+xT)*2 + (yG+zC)*4 - 16.6*log 10 (0.050) + 16.6*log 10 ([Na + ]) Один праймер по факту просто участок начала целевой последовательности, а второй – обратно комплементарен концу А что по специфичности?
Амплификаторы Очень удобно, что крышка нагревается По факту просто очень дорогая и точная печка для маленьких объемов
Визуализация Нужен агарозный гель с красящим агентом внутри И обязательно должно быть с чем сравнить Этидий бромид хорошо светит в УФ
БуЪ !
