О п атогенност и микроорганизмов Задачи и методы клинической микробиологии С ПбГУ 20 1 2
"Уровень познания природы человеком можно оценивать не только по сумме узнанного и понятого, но также и по сумме осознанного незнания ".
1. Определение патогенности 2. Атрибуты патогенности 3. Патогенные МО 4. Условия развития патогенного процесса 5. Контроль за проявлением патогенных свойств МО 6. Вирулентность 7. Факторы патогенности 8. Классификация МО по патогенности 9. Формирование патогенных штаммов МО 10. Функции "островов патогенности"
Патогенность Вирулентность Патогенные микроорганизмы Факторы патогенности
Патогенность от греч. pathos – страдание, болезнь genos - рождение
Классические атрибуты патогенности бактерий: 1. инфективность 2. инвазивность (только внутриклеточное проникновение) 3. токсигенность
1. адгезивность 2. инвазивность (общая) 3. токсигенность
Это микроорганизмы, способные преодолевать защитные силы макроорганизма и вызывать инфекционный процесс в организме человека, животных и растений
Развитие инфекционного процесса – результат взаимодействия двух систем: СООБЩЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ И МАКРООРГАНИЗМА Развитие инфекционного процесса зависит от : лабильности перестройки метаболизма патогенных микроорганизмов и физиологических особенностей и иммунореактивности макроорганизма
Осуществляется на генетическом уровне Является результатом сложного взаимодействия бактериальной хромосомы и генов специфических плазмид
Для оценки степени патогенности существует количественная мера: первое определение вирулентность - это количественная мера патогенности определенной бактериальной культуры в отношении определенного макроорганизма при определенных условиях заражения
это степень патогенности, при которой возбудитель способен инфицировать макроорганизм и вызвать заболевание
1. количества инфицирующих бактерий 2. пути их поступления в организм 3. набора факторов патогенности у данных микроорганизмов 4. специфических и неспецифических защитных механизмов организма-хозяина
вычисляя количество бактерий, необходимое для гибели животного в определенный период времени при определенном способе поражения: единицы измерения вирулентности : DL - летальная доза – наименьшее количество МО, способное вызвать гибель лабораторных животных LD 50 – летальная доза для 50% лаб. животных DCL – dosis certe letalis – 100% гибель ID - минимальная доза МО, способная вызвать заболевание
Это компоненты бактери альных клеток или вырабатываемые ими вещества, благодаря которым они способны вызывать глубокие изменения в клетках и органах макроорганизма, приводящие к развитию инфекционного процесса Ими могут быть капсула, жгутики, пили, адгезины наружной мембраны, ферменты, токсины
1. адгезия (прикрепление) 2. инвазия (проникновение) 3. токсинообразование (вызывают патоморфологические изменения различных органов и тканей) 4. индуция цитокинов и медиаторов воспаления (приводит к иммунопатологии)
В зависимости от наличия факторов патогенности бактерии условно разделены на три группы: 1. патогенные (вызывают инфекционный процесс) 2. условно-патогенные (вызывают оппортунистические инфекции) 3. непатогенные (не способны вызывать инфекционный процесс)
1. Облигатные паразиты (все этапы жизненного цикла связаны с организмом хозяина) 2. Факультативные паразиты (часть жизненного цикла связана с организмом хозяина) 3. Случайные паразиты (паразитирование в организме – случайная фаза жизненного цикла)
Эволюция бактерий определяется следующими факторами: 1. частотой точечных мутаций 2. высоким уровнем рекомбинаций 3. горизонтальным переносом генов (перенос генетического материалы между бактериями различных видов и родов) Горизонтальный перенос генов – основной механизм эволюции бактерий, ведущий к качественным изменениям состава микробных геномов в течение короткого периода времени
Механизм распространения бактериальных генов путем: 1. конъюгации 2. трансдукции 3. трансформации Мобильный пул генов бактерий состоит из носителей: 1. бактериофаги 2. плазмиды 3. транспозоны 4. геномные « острова патогенности»
"Острова патогенности" – это сегменты бактериальной ДНК, несущие один или несколько генов вирулентности, приобретенные через мобильные генетические элементы: транспозоны, плазмиды или бактериофаги.
1. Определение "клиническая микробиология" 2. 6 групп задач клинической микробиологии 3. Микроскопические методы 4. Культуральные методы 5. Иммунологические методы 6. Иммунологические реакции 7. Диагностические критерии 8. Нарастание титра АТ 9. Молекулярно-биологические методы 10. Неспецифические тесты
Клиническая микробиология – это научная дисциплина, изучающая характер взаимоотношений между макро- и микроорганизмами в норме и, главным образом, в динамике патологического процесса с учетом проводимой антимикробной терапии
самостоятельный статус в 50-60-е гг. XX в. обнаружено и описано много новых возбудителей заболеваний открыто явление возрастания устойчивости возбудителей к АМП началась активная разработка методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний
базируется на клинико-диагностических лабораторных исследованиях инфекционных заболеваний позволяет лучше понять стратегию и тактику врача при встрече с патологией, вызванной возбудителями инфекционных заболеваний
Оценить природу возбудителя и как можно быстрее идентифицировать его. уметь отличить возбудителя заболевания от представителя нормальной микрофлоры.
Правильно выбрать орган и место, откуда необходимо брать материал у больного на исследование. Напр., Salmonella typhi, сначала находится в тонком кишечнике, с 10-го дня начала инфекционного процесса персистирует в крови, а на 5-й неделе снова попадает в тонкий кишечник.
Соблюдать правила взятия и транспортировки клинического материала от больного. Например, при подозрении на менингит и коклюш материал берут из верхних дыхательных путей тампоном на проволочке, который загнут под углом 45°. менингит – вверх коклюш – вниз
Правильный выбор условий выращивания возбудителя заболевания. Главная цель - получение чистой культуры. Нужно подобрать состав питательной среды и условия выращивания (температуру и аэрацию).
Выбор соответствующей антимикробной терапии. Желательно еще до получения окончательных результатов лабораторных исследований. На основании: предварительных микроскопических исследований узнать тип строения клеточной стенки (Гр+ или Гр-), при выявлении чувствительности микроорганизмов к АМП в процессе выращивания
Правильная интерпретация результатов лабораторных исследований. с учетом и во взаимосвязи со всем комплексом клинической информации о больном
1. Микробиологические 2. Иммунологические 3. Молекулярно-биологические 4. Неспецифические лабораторные тесты
1.Микроскопические 2.Культуральные
Прямое исследование патологического материала от больного: 1. световая микроскопия 2. люминесцентная микроскопия 3. электронная микроскопия
Цель –морфологическая характеристика возбудителя по форме, размерам, подвижности, наличию спор. Достоинства –в большинстве случаев очень полезны, т.к. достаточно быстры. Недостатки - для диагностики имеют лишь ориентировачное значение, а результат расценивается как предварительный. Световая микроскопия включает: микроскопию нативного материала – влажные препараты микроскопия фиксированных, окрашенных препаратов
Мазок обрабатывают не красителем, а сывороткой, содержащей АТ, конъюгированные с флюорохромом. В том случае, если АТ гомогенны АГ микроорганизмов, в люминесцентном микроскопе можно увидеть свечение. Метод характеризуется высокой специфичностью
ТЭМ – трансмиссионная (просвечивающая) ЭМ СЭМ –сканирующая (растровая) ЭМ ИЭМ – иммунная ЭМ
Выделение чистой культуры Идентификация выделенной чистой культуры Определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам
Путем посева на питательные среды является основным этапом микробиологического исследования. Успех выделения чистой культуры зависит от правильного выбора питательной среды и условий выращивания.
После получения чистой культуры проводят идентификацию микроорганизмов по совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств.
Escherichia coli : Pink colonies (lactose fermentation) Proteus mirabilis : Colorless colonies, no spreading
Выбор тактики лечения основан на определении чувствительности микроорганизмов к АМП Выявленная чувствительность in vitro не всегда гарантирует высокую клиническую эффективность in vivo. Это зависит от ряда причин: Приобретение устойчивости к АМП в процессе лечения Особенности всасывания АМП клетками слизистой оболочки кишечника АМП не могут проникать в очаг воспаления где образуется бактериальная биопленка и т.д.
1.Методы поиска антигенов возбудителей инфекционных заболеваний с помощью имеющихся антител. 2. Методы поиска антител – выявление активного иммунного ответа – по нарастанию титра АТ (используют диагностикумы). Это методы серодиагностики и аллергодиагностики
Высоко чувствительные Быстрые Достаточно дешевые
В большинстве случаев - ретроспективный характер нельзя получить информацию о чувствительности возбудителя к АМП Применение серодиагностики для оценки эффективности лечения возможно только при хронических формах заболевания.
РН – реакция нейтрализации РСК – реакция связывания комплемента ИФА – иммуноферментный анализ РИФ – реакция иммунофлюоресценции РНГА – реакция непрямой гемагглютинации ИЭМ – иммунная электронная микроскопия
Только в некоторых случаях (гепатит или сифилис) сам факт обнаружения АТ имеет диагностическое значение Чаще диагноз ставят на основании нескольких диагностических критериев : 1. Диагностический титр АТ (Д-титр); 2. Нарастание титра АТ
условная величина, обозначающая количество АТ в сыворотке крови к конкретному возбудителю. Превышение определенного уровня АТ может быть расценено как признак заболевания. Величина Д-титра устанавливается эмпирическим путем для каждого заболевания и для каждой серологической реакции. Д-титры могут не совпадать при обследовании различными серологическими методами.
Современные методы серодиагностики позволяют получать информацию о наличии Ig разной специфичности
IgM IgG I -й контакт с II -контакт с возбудителем возбудителем
Методы выявления ДНК или РНК возбудителя (ПЦР) PCR Методы определения структуры 16S рРНК малой субъединицы бактериальной рибосомы – метод риботипирования
Полимеразная цепная реакция - метод выявления ДНК или РНК возбудителя
Разработал амер. исс.- Кэрри Муллис, Ноб. лауреат 1993г. 1985г. in vitro - репликация участков ДНК. Цель - обнаружение незначительных количеств ДНК (вирусной, бактериальной, простейших) в клиническом материале от больного. Не является абсолютно точным (случаются ошибки), но он очень специфичен, т.к. основан на уникальном свойстве ДНК – комплементарности, при этом должно произойти взаимодействие участков ДНК возбудителя из клинического материала от больного и имеющихся в диагностическом наборе фрагментов ДНК-возбудителя – праймеров.
1. выделение ДНК 2. амплификация 3. детекция
Материал: кровь, любая ткань, моча, кость, соскобы со слизистых специальными щеточками. Идентификация останков тоже осуществляется этим способом, т.к. в костях ДНК сохраняется много десятков лет. Этот этап очень ответственный, необходимо использовать специальные приемы для взятия материала, правильной транспортировки. Лучше всего брать материал и сразу же проводить исследование. 1-й этап - выделение ДНК возбудителя из клинического материала
Умножение ДНК возбудителя из клинического материала. 25-35 циклов умножения. Теоретически можно иметь всего 1 копию ДНК возбудителя в клиническом материале и ее размножить.
Определение интересующих фрагментов ДНК – нуклеотидов.
ДНК-возбудителя из кл. материала – фрагмент нуклеотидов, который нужно определить. Смесь нуклеотидов – супермикст, из которых будет строиться новые, вновь синтезируемые фрагменты ДНК. Затравки - праймеры – искусственно синтезированные фрагменты ДНК (олигомеры), Соответствующие фрагментам ДНК определенных возбудителей. Они нужны для того, чтобы начался синтез новой цепочки ДНК только в том случае, если ДНК-возбудителя из клинического материала комплементарно совпадет с ДНК-затравкой, соответствующей ДНК предполагаемого возбудителя. ДНК - полимераза (термостабильная) – фрагмент, сшивающий нуклеотиды (из термофильной бактерии Thermus aquaticus ).
Объемы реактивов, используемые в работе: Объем супермикса – 20 мкл Объем ДНК-полимеразы – 20 мкл Обязательное условие – соблюдение идеальной чистоты!!!
1. Денатурация (ДНК возбудителя из клин. материала) Т° = 94°С → 2 цепочки расходятся, рвутся водородные связи между азотистыми основаниями → 1-цепочечные молекулы ДНК. С этого момента 1-цеп. молекулы ДНК возбудителя называются – амплификатор 1 и 2. При 94°С
амплификатор 1 связывается с праймером 1 амплификатор 2 с праймером 2 Связывание происходит в случае комплементарного совпадения участка праймера с амплификатором. Праймеры должны соответствовать предполагаемым возбудителям. При 62°С.
ДНК достраивается из нуклеотидов супермикста. Строится ампликон. Именно эту реакцию осуществил Кэрри Муллис в 1985г. Скорость синтеза – 1 нуклеотид/ 1 мин. Все повторяется примерно 30 раз. Занимает 2,5 часа. При 72°С (оптимальная температура для работы термостабильной ДНК-полимеразы.
Существует несколько способов: Электрофорез в агарозном геле ДНК – гибридизация ИФА на микрочастицах
Высокая чувствительность Высокая специфичность
Интенсивности инфекционного процесса Правильного отбора проб Сроков и условий транспортировки материала Правильного выделения ДНК из материала Качества реактивов Точности этапа амплификации Эффективности системы детекции результатов
Неспецифические лабораторные тесты
Обнаружение в исследуемом материале продуктов метаболизма бактерий (обнаружение токсинов при ботулизме) Неспецифические тесты, по характеру отклонения которых можно судить о наличии патологических изменений, специфических для инфекционного процесса определенной этиологии (нарастание активности трансаминазы)
