Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА БИОХИМИИ, БИОТЕХНОЛОГИИ И ФАРМАКОЛОГИИ Направление: 06.03.01 «Медицинская биохимия» КУРСОВАЯ РАБОТА ОЦЕНКА ТEЛOМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРЫС ПРИ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКЕ Выполнена 3 курс, группа №01-701, А. Д. Мухаметшина Научный руководитель доц., канд. биол. н аук О.А. Кравцова Казань - 2020
2 Большинство доступных в настоящее время исследований, посвященных взаимосвязи между активностью тeлoмеразы и физическими нагрузками, все еще являются экспериментальными исследованиями с небольшими размерами выборки. В изученной литературе сообщается о многогранной взаимосвязи, причины которой в настоящее время неизвестны. В частности, существуют поразительные расхождения между результатами, касающимися связи между уровнем физической нагрузки и тeлoмеразной активностью. Учитывая важность открытия того, что острый психологический стресс может привести к быстрым и преходящим изменениям активности тeлoмеразы РВМС ( Epel et al.; 2010), важно изучить влияние физических упражнений с высокой и умеренной нагрузкой, а также влияние гормонов и других важных биологических макромолекул на организм. Актуальность Результаты работы создают основу для понимания одного из молекулярных механизмов окислительного катаболизма молекул ДНК в экстремальных состояниях, таких как физическая нагрузка, а также стресс, вызванный гиподинамией организма.
3 Цель и задачи исследования Целью данной работы является рассмотреть влияние острого психического стресса, вызванный тяжёлыми физическими нагрузками и влияние умеренного стресса, под действием также физических упражнений, но с умеренным характером на активность теломеразы. Исходя из поставленных целей сформулированы следующие задачи: Определить влияние пола и типа нервной системы на активность теломеразы ; Оценить активность тeлoмеразы лейкоцитов крыс в трёх экспериментальных группах—спорт, стресс, спорт+стресс — и контроля методом qPCR.
4 Материалы и методы Методы поиска литературы : В электронных базах данных PubMed, Киберленинка, и поисковых сайтах Google и Яндекс проводились поиски оригинальных исследований и обзоров литературы, написанных на английском и русском языках. Лабораторные методы : В качестве удобного объекта для изучения влияния физических упражнений на организм были выбраны крысы. Всего было исследовано 50 крыс, 10 из которых являются самками, 40 самцами. Забор крови на лейкоциты и сыворотку осуществлялся в виварии, при КГМУ. Забор крови проводили из латеральной хвостовой вены или вентральной/дорсальной артерии. Процедура выполнялась путём установки иглы шприца в сосуд. Образецы крови выделялись для определения активности тeлoмеразы, и для анализирования уровня гормонов стресса, ЛДГ, пролактина, глюкозы и тестостерона. Анализы сделаны в ЦНИЛ г. Казани Подсчёт лейкоцитов осуществлялся помощью ручного метода в счетной камере Горяева. Определение уровней биологически важных молекул во время стресса в крови. Уровень пролактина, тестостерона, глюкозы, ЛДГ, креатинкиназы, кортизола определяли с помощью набора реактивов для определения концентрации соответствующей биомолекулы в сыворотке и плазме крови фирмы «ВЕКТОР-БЕСТ». Определение теломеразной активности лейкоцитов у крыс. Активность тeлoмеразы измерена in vitro с помощью способности добавлять теломерные повторы к специально сконструированным олигонуклеотидным праймерам. Анализ активности тeлoмеразы выполнена путем выявления продуктов амплифицированной теломерной ДНК с использованием количественная ПЦР в реальном времени ( qPCR setup ). . Методы поиска литературы и лабораторные методы :
4 Материалы и методы Выбор испытуемых грызунов и проводимые над ними эксперименты. Крыс распределяли на экспериментальные группы по типам характера с помощью теста Порсолта, который включает в себя принудительное погружение в воду организма и наблюдение за характером действия крыс. Стрессовый фактор был вызван гиподинамией крыс, путём закручивания подопытных в тканевый материал, с помощью чего обеспечивалась обездвиживание крыс. Осуществление стресс-теста происходило в течение двух недель подряд каждый день с 10 февраля по 23 февраля 2020 года. Испытуемые находились в обездвиживании в течение 90 минут. Физические нагрузки давались с грузом 7% от массы тела и запускались в бассейн на плавание на 6-10 минут. Время нагрузки подбиралась в зависимости от адаптивных возможностей и физического состояния подопытного организма. Сроки и место выполнения работы : Работа выполнялась на базе ЦНИЛ КГМУ с период с апреля 2019 года по апрель 2020 года. Нашей исследовательской группе были предоставлены крысы в двух партиях: Первая партия, которая поступила в сентябре 2019 года, состоит из 40 крыс из которых 30 самцы, 10 самок. Вторая партия, которая поступила в феврале 2020 года состоит из 49 крыс, из которых 26 самок, 23 —самца. Забор крови проходи в виварии при КГМУ. Определение характера крыс, проводимым путём теста Порсолта, а также физические нагрузки проходили в экспериментальной лаборатории « фармэксперт » в КГМУ. Физические нагрузки проводились в бассейне, при температуре воды не менее 19`С. Стресс был вызван путём гиподинамии крыс. Данный эксперимент проводился в виварие при КГМУ. Активность тeлoмеразы определялась в Центральной Научно-исследовательской лаборатории г.Казани. Экспериментальные методы :
5 Результаты При оценке результатов, мы измеряли средние исследуемые значения активности теломеразы в зависимости от пола подопытного организма. Мы посчитали средние значения исследуемых параметров в 1 точке, в соответствии с таблицей 2 и рисунком 4: Таблица 2- Средние значения активности теломеразы в первой точке в зависимости от пола. Пол Cq теломеразы акт. Относительная активность теломеразы м 36,04 5,51 ж 34,6 4,48 Рисунок 4- Сравнение средних значений активности теломеразы в зависимости от пола в первой точке.
6 Результаты Далее проводили такие же измерения, но уже во второй точке эксперимента, в соответствии с таблицей 3 и рисунком 5. Таблица 3- Средние значения активности теломеразы во второй точке эксперимента в зависимости от пола. Пол Cq теломеразной акт. Относительная активность теломеразы м 32,94 0,73 ж 32,79 0,8 Рисунок 5- Сравнение средних значений активности теломеразы в зависимости от пола во второй точке эксперимента.
6 Результаты При оценке результатов, мы также измеряли средние исследуемые значения активности теломеразы в зависимости от нервной системы подопытного организма. Мы посчитали средние значения исследуемых параметров в 1 точке (таблица 4, рисунок 6): Таблица 4. Средние значения активности теломеразы в первой точке в зависимости от нервной системы. Тип НС Cq теломеразы акт. Относительная активность теломеразы активный 36,34 2,95 пассивный 35,01 7,7 Рисунок 6. Сравнение средних значений активности теломеразы в зависимости от типа нервной системы крысы. Первая точка эксперимента
6 Результаты Далее также проводили такие же измерения, но уже во второй точке эксперимента, в соответствии с таблицей 5 и рисунком 7. Рисунок 7- Сравнение средних значений активности теломеразы во второй точке, в зависимости от типа нервной системы подопытных крыс. Таблица 5-Средние значения активности теломеразы во второй точке в зависимости от нервной системы. Тип НС Cq теломеразы акт. Относительная активность теломеразы активный 33,04 0,67 пассивный 32,79 0,81
6 Результаты Следующим этапом, была оценка изменения показателей в динамике: У 15 исследуемых особей в начале, т. е. в первой точке была неактивная теломераза, а после экспериментов стала активной, большинство данных особей относились к группе «спорт» или являлись контрольной группой У трех исследуемых крыс в начале эксперимента была активна теломераза, а во второй точке, то есть, после проводимых испытаний, стала неактивна. Хотелось бы подчеркнуть, что две данные особи из трех находились во второй группе, т. е. подвергались сильному стрессу, а одна особь принадлежала к группе контроля.
7 Значимых различий в активности теломеразы в зависимости от пола исследуемых крыс не выявлено. Активность теломеразы была существенно выше у активных крыс, по сравнению с пассивными (тип поведения определен тестом Порсолта ) Активация теломеразы зафиксирована у крыс, входящих в группу с интенсивными физическими нагрузками и контроля, тогда как в группе с хроническим стрессом значимых изменений не выявлено. Выводы
