Ротанов Сергей Владимирович д.м.н., доцент ФГБУ “ ГНЦДК ” Минздрава России, г. Москва ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва Основы лабораторной диагностики сифилиса на современном этапе ЭЛЕКТИВЫ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МЗ России Москва, 02.12.201 5 г.
Сифилис Мягкий шанкр Гонорея Четверная венерическая болезнь или паховый лимфогранулёматоз Венерические заболевания ИППП Сифилис Гонорея Хламидиоз Трихомоноз Шанкроид (мягкий шанкр) Уреаплазменная ( микоплазменная ) инфекция Генитальный герпес Аногенитальные бородавки ВИЧ-инфекция (СПИД)
Класс I - Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Класс II - Новообразования Класс III - Болезни крови, кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм Класс IV - Болезни эндокринной системы, расстройства питания и нарушения обмена веществ Класс V - Психические расстройства и расстройства поведения Класс VI - Болезни нервной системы Класс VII - Болезни глаза и его придаточного аппарата Класс VIII - Болезни уха и сосцевидного отростка Класс IX - Болезни системы кровообращения Класс X - Болезни органов дыхания Класс XI - Болезни органов пищеварения Класс XII - Болезни кожи и подкожной клетчатки Класс XIII - Болезни костно-мышечной системы и соединительной ткани Класс XIV - Болезни мочеполовой системы Класс XV - Беременность, роды и послеродовой период Класс XVI - Отдельные состояния, возникающие в перинатальном периоде Класс XVII - Врожденные аномалии, деформации и хромосомные нарушения Класс XVIII - Симптомы, признаки и отклонения от нормы, выявленные при клинических и лабораторных исследованиях, не классифицированные в других рубриках Класс XIX - Травмы, отравления и некоторые другие последствия воздействия внешних причин Класс XX - Внешние причины заболеваемости и смертности Класс XXI - Факторы, влияющие на состояние здоровья населения и обращения в учреждения здравоохранения Классификация ИППП по МКБ-Х
Класс I : Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Блок (A00-A09) - Кишечные инфекции Блок (A15-A19) - Туберкулез Блок (A20-A28) - Некоторые бактериальные зоонозы Блок (A30-A49) - Другие бактериальные болезни Блок (A50-A64) - Инфекции, передаваемые преимущественно половым путем Блок (A65-A69) - Другие болезни, вызываемые спирохетами Блок (A70-A74) - Другие болезни, вызываемые хламидиями Блок (A75-A79) - Риккетсиозы Блок (A80-A89) - Вирусные инфекции центральной нервной системы Блок (A90-A99) - Вирусные лихорадки, передаваемые членистоногими, и вирусные геморрагические лихорадки Блок (B00-B09) - Вирусные инфекции, характеризующиеся поражениями кожи и слизистых оболочек Блок (B15-B19) - Вирусный гепатит Блок (B20-B24) - Болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека [ВИЧ] Блок (B25-B34) - Другие вирусные болезни Блок (B35-B49) - Микозы Блок (B50-B64) - Протозойные болезни Блок (B65-B83) - Гельминтозы Блок (B85-B89) - Педикулез, акариаз и другие инфестации Блок (B90-B94) - Последствия инфекционных и паразитарных болезней Блок (B95-B97) - Бактериальные, вирусные и другие инфекционные агенты Блок (B99) - Другие инфекционные болезни Классификация ИППП по МКБ-Х
Класс: Некоторые инфекционные и паразитарные болезни Блок: Инфекции, передаваемые преимущественно половым путем А50.0 - 50.9 Врожденный сифилис (клинические формы) А51.0 - 50.9 Ранний сифилис (клинические формы) А52.0 - 52.9 Поздний сифилис (клинические формы) А53.0 - 53.9 Другие неуточненные формы сифилиса А54.0 - 54.9 Гонококковая инфекция (клинические формы) А55 Хламидийная лимфогранулема (венерическая) А56.0 - 56.9 Другие хламидийные болезни, передаваемые половым путем А57 Шанкроид (мягкий шанкр) А58 Паховая гранулема А59.0 - 59.9 Трихомоноз А60.0 - 60.9 Аногенитальная герпетическая вирусная инфекция [ herpes simplex ] А63 Другие болезни, передаваемые преимущественно половым путем, не классифицированные в других рубриках А64 Болезни, передаваемые половым путем, неуточненные Классификация ИППП по МКБ-Х
Количество новых случаев ИППП в разных регионах мира по данным ВОЗ ( 201 3 год ) 38 млн 22 млн 14 млн 151 млн 17 млн 1 млн 18 млн 10 млн 69 млн Заболеваемость ИППП в России (на 100 000 населения) 333 852 случаев ИППП в 2013 г.
ИППП поражают в основном молодых, сексуально активных людей ИППП снижают качество жизни ИППП – причина: бесплодия невынашивания беременности младенческой смертности Нарушают репродуктивное здоровье нации и воспроизведение численности населения
перечень социально значимых заболеваний А 15-19 туберкулёз А 50 - 64 инфекции, передаваемые преимущественно половым путем В 16-18.0-18.1 гепатит В В 17.1-18.2 гепатит С В 20-24 болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) С 00-97 злокачественные новообразования Е 10-14 сахарный диабет F 00-99 психические расстройства и расстройства поведения I 10-13.9 болезни, характеризующиеся повышенным кровяным давлением Постановление Правительства Российской Федерации №715 от 1 декабря 2004 г. «Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих»
перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих В 20 - 24 болезнь, вызванная вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) А 90 - 99 вирусные лихорадки, передаваемые членистоногими, и вирусные геморрагические лихорадки В 65 - 83 гельминтоз В 16-18.0-В 18.1 гепатит В В 17.1-18.2 гепатит С А 36 дифтерия А 50 – 64 инфекции, передаваемые преимущественно половым путём А 30 лепра В 50 - 54 малярия В 85 - 89 педикулёз, акариаз и другие инфестации А 24 сап и мелиоидоз А 22 сибирская язва А 15 - 19 туберкулёз А 00 холера А 20 чума П остановление Правительства Российской Федерации №715 от 1 декабря 2004 г. «Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих»
Сифилис является антропонозной инфекцией, вызываемой Treponema pallidum, с преимущественно половым путём передачи инфекционного агента, с характерной периодизацией развития и проявления клинических признаков, склонной к хроническому рецидивирующему прогредиентному течению, способное поражать все ткани и все системы органов
Заболеваемость сифилисом в странах Европы (на 100 000 населения 2013 год) Russian Federation 28.9 European Region 1 1.6 Source : WHO/ Europe, European HFA Database, July 2013 <= 80 <= 64 <= 48 <= 32 <= 16 no data
Возбудителем сифилитической инфекции является T. pallidum, открытая F. S с haudinn и E. Hoffmann 3 марта 1905 года немецкий протистозоолог Fritz Schaudinn (1871-1906) немецкий дерматовенеролог Paul E. Hoffmann (1968-1959)
порядок Spirochaetales семейство Spirichaetaceae род Treponema вид T. pallidum подвид pallidum ( Schaudinn et Hoffmann, 1905) (возбудитель сифилиса) pertenue ( Castellani, 1905) (возбудитель фрамбезии) endemicum (возбудитель эндемического сифилиса, беджели ) carateum (возбудитель пинты)
микроорганизм спиралевидной формы с завитками одинаковыми по высоте и расстоянию между ними длина T. pallidum от 4 до 16 мкм, толщина в поперечнике 0,2-0,25 мкм, концы заострены количество завитков от 8 до 12, но может значительно варьировать в различные периоды жизненного цикла микроорганизма ближе к концам завитки имеют меньшую высоту и большее расстояние между ними
для изучения морфологии микроорганизма наилучшим методом окраски является окраска по Романовскому - Гимзе ( T. pallidum - бледно-розового цвета, другие трепонемы - более темного цвета с синим или фиолетовым оттенком) серебрение по Морозову – цвет коричневый или почти черный
S. intestinalis в смеси с холерным вибрионом S. Obermeyeri T. pallidum S. Vincenti-Piauti и B. fusiformis B A C D
В работах отечественных ученых (ГНЦДК) Н.М. Овчинникова, В.В. Делекторского была подробно описана морфология бледной трепонемы, определены её размеры и структура, описаны: клеточная стенка, фибриллы, блефаропласты и другие компоненты, описаны цисты и L- формы возбудителя сифилиса
путем поперечного деления х 50 000 х 1 50 000
путем образования гранул, зерен половой путь
извитая цисты зерна и гранулы х 10 000 х 44 000 х 21 000 х 60 000 L- формы х 20 000
В 1998 году группой исследователей из США [С. M. Fraser et al. ] был расшифрован геном T. pallidum. Полная нуклеотидная последовательность генома T. pallidum составляет 1138 006 п.н.о. Геном микроорганизма включает 42 семейства генов, ответственных за основные жизнеобеспечивающие функции механизмы репликации, транскрипции, трансляции ДНК, энергетический метаболизм, процессы клеточного деления и секреции белков. В геноме отсутствует ген recA, ответственный за генетическую рекомбинацию и восстановление поврежденной ДНК, что объясняет высокий консерватизм генома. TAGATGGACGCAGTAGGGTATGAAGTATTCTGGAACGAGACACTCAGCCAGATACGGAGTGAATCGACCGATTTAACATGTGGTTTGCTCATTTGTTCTTTATCGCATCTTTTGAAAACGCTATCGAAATAGCCAGACTTTTTCCGAATACAGTTTAGCCAAAAATATCAAGAAAAGCTTGAGCGCAAGTTCCTCAACTTTCTGGACACCCCATTAACTTTTGTTTGCCGTTAAAAAAGGCACCCCTC
Бледная трепонема - облигатный паразит, что обусловлено небольшим размером генома, лимитирующим обеспечение некоторых процессов биосинтеза собственными силами, в частности синтеза липидов; микроорганизм в ходе эволюции приспособился выживать исключительно за счёт организма хозяина. В этой связи, важную роль в её жизнедеятельности играет транспорт необходимых питательных веществ из окружающей среды, что обусловливает присутствие широкого репертуара транспортных белков с большим выбором субстратных специфичностей. Геном бледной трепонемы
факультативный анаэроб, микроаэрофил характерен упрощенный метаболизм (облигатный паразит) плохо культивируется на искусственных питательных средах, при культивировании теряет свойство патогенности экспериментальный сифилис температурный оптимум существования 35-37 С высокая чувствительность к АМП, pH среды медленный рост и длительные периоды покоя между делениями клетки Характеристика биологических свойств T. pallidum
вращательное (ротаторные) - вокруг продольной оси, благодаря чему микроорганизм «ввинчивается» в структуру тканей поступательное - продвижение вперед и назад контрактильное - волнообразные колебания, пробегающие по всему телу микроорганизма сгибательное - в различных направлениях под острым углом, благодаря чему могут наблюдаться V- образные фигуры маятникообразное ( качательное, бичеобразное ) - в случае прикрепления одним концом к неподвижному плотному субстрату
инкубационный ( 0 - 3-4 недели) первичный (3-4 недели - 2-2,5 месяца) вторичный (2,5 месяца - 2-5 лет) третичный (3-5 лет - и более) Периоды течения сифилитической инфекции Клинические формы сифилитической инфекции: Сифилис кожи и видимых слизистых оболочек Кардиоваскулярный сифилис Сифилис с поражением паренхиматозных органов Нейросифилис Сифилис с поражением опорно-двигательного аппарата
Диагностика сифилитической инфекции: жалобы анамнез данные клинического осмотра контфронтация результатов обследования половых партнёров результаты лабораторных ис следований результаты инструментального обследования путем проведения пробного лечения
Прямые методы детекция возбудителя Treponema pallidum или его генетического материала Непрямые методы иммунохимические, основанные на определении антител к наиболее специфичным антигенам Treponema pallidum
микроскопия в тёмном поле ( ТПМ ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) окраска по Романовскому Гимзе серебрение по Морозову окраска ПИФ
микроскопия в тёмном поле ( ТПМ ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) окраска по Романовскому Гимзе серебрение по Морозову окраска ПИФ
райц-серум (применимо для диагностики первичного, вторичного и раннего врожденного сифилиса); пунктат увеличенных регионарных лимфатических узлов; цереброспинальная жидкость (ликвор) (при подозрении на нейросифилис исследуют осадок, полученный при центрифугировании образца); при врожденном сифилисе исследуют амниотическую жидкость, межтканевую жидкость из ткани плаценты или серозный материал из пузырных элементов на коже новорожденного
Метод раздражения - поверхность эрозивного или язвенного дефекта очищают тампоном, смоченным стерильным физ.раствором; стерильной ложкой Фолькмана производят осторожные, поглаживающие движения по поверхности элементов, избегая повреждения сосудов; поверхность становится блестящей в результате просачивания тканевой жидкости, которую собирают на предметное стекло или в микропробирку. Метод сдавливания - после очистки поверхности эрозии или язвы твердый шанкр или папулезный элемент в основании сдавливают с боков пальцами или пинцетом. Сдавливание тканей стимулирует выделение серозного экссудата, который накапливается на поверхности морфологического элемента. Метод скарификации - поверхность сухих элементов (розеол или папул) скарифицируют иглой для взятия крови хирургическим скальпелем, останавливают капиллярное кровотечение, затем методом раздражения поверхности получают серозную жидкость Комбинирование методов раздражения и сдавливания.
Объекты исследования проявления первичного и вторичного сифилиса на коже и видимых слизистых оболочках поражения при раннем врождённом сифилисе поражения при Lues III (материал из глубины инфильтрата или со дна язвы) увеличенные регионарные лимфатические узлы Спинномозговая жидкость Амниотическая жидкость
Признаки T. pallidum ssp. pallidum T. refringe n s T. phagedenis ( reiteri ) T. denticola Число завитков (интервал) 8-12 (6-20) 2-3 10-12 (10-30) 6-8 Длина, мкм (интервал) 10 ( 4 - 1 6) 5-8 (5-16) 10-12 (10-30) 8 (6-16) Толщина, мкм 0,13-0, 3 5 0,2-0,3 0,2-0,25 0,15-0,2 Длина завитка, мкм 1,1 1,8 1,4-1,6 0,9 Глубина завитка, мкм 0,5-0,7 0,2-0,3 0,2-0,3 0,1-0,4
Виды движений T r. pallidum ssp. pallidum T r. refringe n s T r. phagedenis ( Tr. reiteri) T r. denticola поступатель-ное медленное, свободное быстрое медленное, свободное, c резкими толчками медленное, свободное вращательное от медленного к быстрому, может вращать - ся на месте очень быстрое от медленного к быстрому, вращается на месте от медленного к быстрому, часто с резки-ми толчками волнообразное мягкое, равномерное с выра - женными изгибами колебательное, с резкими толчками мягкое, крутящееся колебательное сгибательное имеется нет нет, иногда отме - чается движение на концах нет маятнико - образное имеется нет нет нет
Принцип метода : в результате взаимодействия моноклональных анти- T. pallidum антител, меченных ФИТЦ, и бледной трепонемы при люминесцентной микроскопии наблюдается специфическое ярко-зеленое свечение Преимуществом ПИФ перед темнопольной микроскопией - возможность дифференцировки патогенных трепонем от непатогенных при исследовании материала с проявлений на слизистых оболочках полости рта и прямой кишки, может быть использован материал, полученный при биопсии или аутопсии
микроскопия в тёмном поле ( ТПМ ) реакция прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) патоморфологические исследования молекулярно-генетические исследования (МАНК): полимеразная цепная реакция (ПЦР) окраска по Романовскому Гимзе серебрение по Морозову 0,10% 0% 0,01% ? % окраска ПИФ
низкие показатели аналитической чувствительности ряда методик исследования (ТПМ, ПИФ), что обусловлено малым количеством копий возбудителя в образцах клинического материала, фоновым влиянием другого генетического материала в исследуемой пробе; отсутствие возможности получить клинический материал для исследования при скрытых клинических формах инфекции; отсутствие методик выявления и идентификации измененных форм возбудителя (цисты, L- формы, зёрна);
Существующие методы прямого обнаружения возбудителя сифилиса не всегда позволяют дать ответ о наличии T. pallidum в очаге : В этих условиях перспективным для диагностики может явиться разработка протеомного профилирования бледной трепонемы Технология, позволяет исследовать экспрессию, локализацию и взаимодействие белков в клетке возбудителя заболевания с целью выявления и инвентаризации уникальных белков, закодированных в геноме исследуемого микроорганизма Основной методом протеомного анализа масс-спектрометрия, позволяющая определять массу и заряд исследуемых белков с их последующей идентификацией по библиотекам данных получаемый белковый спектр является уникальной характеристикой патоге на
основаны на определении в жидких средах организма пациентов антител против специфических антигенов возбудителя; биологическим материалом служат: сыворотка / плазма крови или ликвор ; применимы для диагностики всех клинических форм сифилиса, а также для КСК состояния здоровья пациентов после проведения специфического лечения Непрямые иммунохимические исследования для диагностики сифилиса Трепонемные тесты ( ТТ ) Нетрепонемные тесты ( НТТ )
важной вехой в развитии методов лабораторной диагностики сифилиса явилось применение в 1906 году А. Вассерманом совместно с А. Neisser и C. Bruck реакции связывания комплемента ( РСК ) для определения антител к T. pallidum А lfred fon Wasserman
трудоемкий метод исследования использует субъективный подход к интерпретации результатов исследования метод, нередко дающий ложные отрицательные и положительные результаты метод, не подлежащий стандартизации, автоматизации и протоколированию результатов метод, не подлежащий внешнему контролю качества отдавая должное исторической роли реакции, предложенной А.Вассерманом, А.Нейссером и С.Бруком, в настоящее время этот метод оценивается как морально устаревший
применяется антиген нетрепонемного происхождения; выявляют гетерофильные IgM и IgG к липидам, входящим в структуру T. р allidum или образующимся при деструкции тканей организма хозяина (что снижает специфичность результатов исследования); определяемые антитела появляются в крови больных сифилисом через 1-2 недели после развития твердого шанкра; клиническая чувствительность тестов– 59–100 %; клиническая с пецифичность – 93-99 %. Преимущества : низкая себестоимость, простота технического выполнения, возможность проведения единичных исследований за короткий промежуток времени. Недостатки : низкая клиническая чувствительность при сифилисе первичном (59-87%) и позднем (37-85%); возможность получения ложно положительных результатов, отсутствие автоматизации и субъективный характер оценки результатов. Н етрепонемные тесты: общая характеристика
при добавлении к образцу ( сыворотке/плазме крови или ликвору ) больного сифилисом кардиолипинового антигена: холестерол 0,98% + кардиолипин 0,03% + лецитин 0,28% ( M. Pangborn, 1941; Л.С. Резникова, 1956) происходит образование комплексов антиген-антитело в виде рыхлого осадка – флоккулята (преципитата), состоящего из мелких хлопьев белого цвета для улучшения визуализации образования осадка в разных модификациях теста - к антигену добавляют частицы древесного угля ( RPR ) или красителей ( толуидиновый красный - TRUST, судан черный – RST, ) ; - учет результатов осуществляют с 2-х лупой ( RPR, РМП ) или под микроскопом ( VDRL, USR ); выпускается готовый к использованию антиген, стабилизированный ЭДТА ( USR ) или мертиолятом ( Люис-тест ).
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов РМП – реакция микропреципитации с плазмой или инактивированной сывороткой крови « Сифилис-АгКЛ-РМП » ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московская обл., Россия) «Антиген кардиолипиновый для РМП, раствор для диагностических целей» ФГУП «НПО « Микроген » (г. Москва, Россия) «ЛЮИС-ТЕСТ» Набор 1 и 2» ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н.Новгород, Россия) Нетрепонемные тесты RPR – быстрый плазмареагиновый тест ( Raped Plasma Reagin ) « Люиc RPR тест» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» (г. Москва, Россия) « Сифилис RPR -тест » ЗАО « ЭКОлаб » ( г. Электрогорск Московской обл., Россия) « SYPHILIS RPR TEST» фирма « Human GmbH» (Wiesbaden, Германия) « SYPHILIS RPR TEST» фирма « NEWMARKET LABORATORIES» ( Великобритания) VDRL – Venereal Diseases Research Laboratory Test ( флоккуляционный тест с VDRL антигеном) « Сифилис- VDRL -тест » ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск Московской обл., Россия) 3,53% 43,57% ? %
Нетрепонемные тесты внесение 90 (150) мкл образца сыворотки крови перенос 90 (150) мкл разведения образца сыворотки внесение 90 (150) мкл изотонического раствора NaCl цельная 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 внесение 90 (150) мкл образца сыворотки крови перенос 90 (150) мкл разведения образца сыворотки внесение 90 (150) мкл изотонического раствора NaCl цельная 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 внесение в каждую лунку по 1 капле суспензии кардио-липинового антигена
Приготовление антигена для проведения реакции РМП – реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой крови набор реагентов « Сифилис-АгКЛ-РМП » комплект 1 производства ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской области) высаливание Ag в физиологич. растворе осаждение Ag при центрифугировании ресуспендирование Ag в 30% растворе холина-хлорида время приготовления Ag 45-60 минут контроль качества приготовленного Ag с контрольными сыворотками
Приготовление антигена для проведения реакции РМП – реакция микропреципитации с плазмой и инактивированной сывороткой крови набор реагентов « Сифилис-АгКЛ-РМП » комплект 2 производства ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской области) ресуспендирование готового к использованию Кл Аг производственного приготовления контроль качества суспензии Кл Аг с контрольными сыворотками, входящими в состав набора реагентов
Нетрепонемные тесты внесение 50 мкл образца сыворотки крови перенос 5 0 мкл разведения образца сыворотки внесение 5 0 м кл изотонического раствора NaCl цельная 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 положительный и отрицательный результат результат RPR TEST 1 2 3 6 4 5 7 8 9 10 1 2 3 4 5 8 7 6 1 К+ К- внесение в каждую лунку по 16 мкл суспензии RPR- кардио-липинового антигена
Виды рекомендуемых нетрепонемных тестов RPR ( Rapid Plasma Reagins ) – быстрый плазмареагиновый тест набор реагентов «Сифилис- RPR -тест» производства ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской области) антиген готовый к применению компоненты длительного хранения наличие контрольных сывороток с известной активностью
проведение скрининга населения на сифилис с целью выявления активных форм течения инфекции; оценка активности гуморального иммунного ответа у больных сифилисом (по уровню содержания реагиновых антител); контроль эффективности проведения специфического лечения (по динамике снижения титра антител в сыворотке крови – снижение титра не менее, чем в 4 раза от исходного в течение 1 года). Нетрепонемные тесты
при добавлении к сыворотке/плазме крови или ликвору больного сифилисом трепонемного антигена в виде: - живой или фиксированной T. pallidum ( РИБТ, РИФ ); - фрагментов разрушенной ультразвуком патогенной T. pallidum, или рекомбинантного целевого белка, сорбированных на эритроцитах ( РПГА ) или желатиновых частицах ( ТР-РА ); - специфических для T. pallidum рекомбинантного или биосинтетического антигенов, сорбированных на твердой фазе ( ИФА, ИБ, ИХЛА, ИХрА, проточная флюорометрия, исследование на белковых биочипах ) происходит образование иммунных комплексов, которые выявляются при использовании разных методических подходов Трепонемные тесты
РИБТ (РИТ) – реакция иммобилизации бледных трепонем - классический тест для выявления специфических трепонемных антител; сложный тест, требующий значительных затрат на содержание лабораторных кроликов и морских свинок; длительность проведения исследован ия. Чувствительность (суммарно по всем стадиям сифилиса) составляет 87,7 %; специфичность - 100 %. Показания к применению : подтверждающий тест на сифилис; применяется в референс-лабораториях. Ограничения применения : тест недостаточно чувствителен на ранних стадиях заболевания; сложен в постановке и интерпретации, трудоемок, используется субъективный элемент в оценке результатов. Трепонемные тесты 0,09%
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов РИФ – реакция иммунофлуоресценции ( FTA - Fluorescent treponemal antibody) « ЛюмиБест » ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл., Россия) « Антипаллидум-Флюороген-IgM / IgG » ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской обл., Россия) Трепонемные тесты РИФ (в особенности РИФ абс ) принята в качестве «золотого стандарта» среди ТТ Чувствительность при первичном сифилисе - 70-100 %, при вторичном и позднем - 96-100 %, специфичность – 94-100 % Показания к применению : подтверждающий тест Ограничения применения: не используется при скрининге больных ввиду трудоемкости, необходим флуоресцентный микроскоп, применяется субъективный фактор оценки результатов. Рекомендации по применению 1,36%
Знания о возбудителе сифилиса были значительно расширены после разработки генно-инженерных технологии производства рекомбинант - ных антигенов и получения пептидов, путём прямого биохимического синтеза в структуре T.pallidum выделяют большое количество антигенов с молекулярной массой от 15 до 97 кDa, из которых от 7 до 15 относят к высоко специфичным для этого возбудителя, в то время как другие антигены нередко проявляют перекрестную реактивность с трепонемами других видов, боррелиями и лептоспирами. высоким иммунным ответом при всех клиниче-ских формах и стадиях сифилиса характеризу - ются антигены TpN 15, 17, 39, 41, 42-44, 47 и некоторые другие, что позволило оптимизиро-вать серологическую диагностику сифилиса Синтез рекомбинантных антигенов
Белок TpN 15 присутствует в структуре T. pallidum, а также T. pallidum subsp. pertenue (возбудитель фрамбезии), но не обнаруживается у непатогенной T. pallidum biotype Reiter. Гуморальный и клеточный иммунный ответ у больного сифилисом на этот антиген развивается позднее, чем на другие антигены. чувствительность тестов с использованием TpN 15 у больных различными формами сифилиса варьирует в пределах 83-100% антитела к нему не обнаруживаются в крови здоровых доноров Антиген TpN 17 является липопротеином ; высокое содержание его обнаруживается во внутренней мембране протоплазматического комплекса клетки T. pallidum, в небольших количествах этот антиген присутствует в структуре наружной мембраны этот антиген является высокоспецифичным для Т. pallidum и может быть использован для дифференциальной диагностики ложноположительных результатов серологических реакций на сифилис антиген TpN 17
Полипептид TpN 39 является главной составляющей поверхностной мембраны Т. рallidum и играет важную роль в запуске иммунитета установлена выраженная реактогенность этого полипептида с образцами сыворотки крови больных первичным и вторичным сифилисом и её быстрое снижение после проведения им специфического лечения антибиотиками ТmpA является периплазматическим белком, участвующим в транспорте металлов через цитоплазматическую мембрану один из первых антигенов, использованных для диагностики сифилиса методом ИФА высокой а/г активностью характеризуется N-концевой фрагмент антигена, состоящий из 19-и остатков аминокислот одинаково высокочувствителен и специфичен при диагностике сифилиса (95%) выявлена зависимость уровня антител к TmpA в сыворотке крови и эффективностью проведенной специфической терапии антиген T m pA
является ферментом - цинк-зависимой карбоксипептидазой в больших количествах продуцируется патогенной Т. pallidum и не обнаруживается у трепонем-комменсалов чувствительность и специфичность ИФА с использованием этого антигена составляет не ниже 92,5 и 90% соответственно.
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов ИФА – иммуноферментный анализ ( ELISA – Enzyme Llinked Immunosorbent Assay) « РекомбиБест антипаллидум - суммарные антитела» « РекомбиБест антипаллидум – IgG » « РекомбиБест антипаллидум – Ig M » ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл., Россия) Трепонемные тесты « ИФА-антипаллидум-скрин (антитела классов M, G, A)» « ИФА-антипаллидум-одностадийный (антитела классов M, G, A)» « ИФА-антипаллидум-IgM » « ИФА-антипаллидум-IgG » ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской области, Россия) «ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-СУММАРНЫЕ АНТИТЕЛА» « ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-IgG » « ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС-IgM » ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н.Новгород, Россия) « СИФ-ДСМ-суммарный » «СИФ- IgG- ДС-стрип « Инвитролоджик Сиф-АТ » « Инвитролоджик Сиф - IgM » ЗАО «Медико-биологический Союз» г. Новосибирск, Россия « ТрепонемаСкрин » ЗАО БТК « Биосервис » (г. Боровск Калужской обл., Россия) «ДРГ Трепонема-скрин ультра» ЗАО «ДРГ Техсистемс » (г. Москва, Россия) 23,08%
ИФА - проводится как в ручном варианте, так и с помощью автоматических иммуноферментных анализаторов; - позволяет исследовать большие потоки образцов; - использует стандартизованные наборы реагентов; - клиническая чувствительность при первичном и вторичном сифилисе – 98-100%, клиническая специфичность – 96-100% Показания к применению : подтверждающий или скрининговый тест на сифилис Трепонемные тесты
“ РекомбиБест антипаллидум … ” (ЗАО “ Вектор-Бест ” ) – рекомбинантные белки, соответствующие основным иммуно-доминантным антигенам T. pal lidum “ ДС-ИФА-АНТИ-ЛЮИС ” (ООО НПО “ Диагностические системы») – Tp 17, Tp 41, Tp 47 “ ИФА антипаллидум-скрин ” (ЗАО “ ЭКОлаб ” ) - p15, p17, p47 и TmpA “ ДРГ Трепонема-скрин ультра ” (фирма “DRG Technology”) – рекомбинантные белки, соответствующие основным иммуно-доминантным антигенам T. pallidum “ ТрепонемаСкрин ” (ЗАО БТК “ Биосервис ” ) - p15, p17, p47 и TmpA “ICE Syphilis” (фирмы Abbott-Murex) – TpN 1 5, TpN 1 7, TpN 47 “Syphilis EIA (II) T А Test Kits” (фирма “ NewMarket Lab.) - TpN 1 5, TpN 1 7, TpN 47
Стадии сифилиса Рекомбинантные антигены TpN 15 TpN 17 TpN 47 TmpA первичный n=84 62, 5% 71,4 % 97, 1% 88, 1% вторичный n =128 99, 2% 100 % 99, 2% 99, 2% латентный n=107 9 7,8 % 9 9,1 % 9 4,4 % 96, 3% все формы сифилиса 8 9,3 % 4 9 2,2 % 3 9 5,6 % 1 9 5, 3% 2 после лечения n=41 8 6,2 % 100 % 56,1 % 48, 8% цит. по Чепурченко Н.В. и др. // Журнал Кл Дерматол и Венерол 2006; 2: 28-31
Разрешены к применению в РФ наборы реаге нтов РПГА – реакция пассивной гемагглютинации (ТРНА - Treponema pallidum hemagglutination assay ) « Люис РПГА тест» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» (г. Москва, Россия) « Сифилис-РПГА-тест » ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской обл., Россия) Трепонемные тесты «РПГА-БЕСТ антипаллидум» ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл., Россия) «ДС-РПГА-АНТИ-ЛЮИС» ООО «НПО «Диагностические системы» (г. Н.Новгород, Россия) «TPHA 1 00», «TPHA 200» и «TPHA 500» фирма « NewMarket Lab. » или « 21 Lab HealthCare » (Великобритания ) набор реагентов « Syphilis (TPHA) фирма « Randox » ( Великобритания) « SYPHILIS TPHA liquid» фирма « Human GmbH» (Wiesbaden, Германия) TP-PA – Treponema pallidum parti с le agglutination assay ( реакция агглютинации сенсибилизированных частиц ) « SERODIA® - TP·PA» фирма « Fujirebio » ( Япония - Нидерланды) 6,75%
РПГА и TP-PA - технически просты для постановки; - не требует специального оборудования; - не занимает много времени; - используются стандартизованные реагентов в коммерческих наборах; - может быть автоматизирован учет результатов теста и их архивирование Чувствительность при первичном сифилисе – 76 %, при вторичном - 100 %, при скрытом - 94-97 %; Специфичность - 98-100 %. Показания к применению: подтверждающий или скрининговый тест на сифилис Трепонемные тесты
Относительно новые лабораторные технологии для диагностики сифилиса, разрешенные к применению в РФ ИБ – иммунноблоттинг (Western dlot ) ИХА, ИХЛА – иммунохемилюминесцентный анализ (CLIA – Chemiluminescence immune assay) ИХрА – иммунохроматографический анализ ( Ро int of care test) xMap – проточная иммунофлюорометрия ИММУНОЧИП – технология исследования на белковых чипах Трепонемные тесты
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов Иммуноблоттинг – линейный иммуноферментный анализ ( Western blot ) « ТрепонемаБлот » ЗАО БТК « Биосервис » (г. Боровск Калужской обл., Россия) « Лайн-Блот Сифилис IgM / IgG » ЗАО « ЭКОлаб » (г. Электрогорск Московской обл., Россия) Трепонемные тесты « recom Blot Treponems IgG » « recomBlot Treponems IgM» фирма « Mikrogen ® GmbH » (Германия) « INNO Lia TM Syphilis score » фирма « INNOGENETICS NV » ( Gent, Бельгия) 0,03%
Иммуноблоттинг (Western Blot) – иммуносорбент представлен полосками ( стрипами ) с фиксированными на них рекомбинантными химерными белками T.pallidum – в реакции использован принцип линейного ИФА – проведение теста, учет и архивирование результатов могут быть автоматизированы Клиническая чувствительность и специфичность – 98 - 100 %. Показания к применению : подтверждающий тест на сифилис в случае, если другие ТТ дают сомнительные или дискордантные результаты. Ограничения применения : высокобюджетный метод исследования, требует значительного времени для постановки, квалифицированного персонала или автоматизированной станции. Трепонемные тесты
Контроли Антигены TpN47 TpN17 TpN15 TmpA 3+ 1+ ± стрептавидин
ТТ не могут быть использованы для контроля эффективности специфического лечения, так как антитрепонемные антитела длительно циркулируют в организме больного, перенесшего сифилис. редко могут давать ложноположительные результаты у больных с аутоиммунными заболеваниями, проказой, онкологической и эндокринной патологией, а также при других заболеваниях, патологических и физиологических состояниях, боррелиозах и лептоспирозах; дают положительные результаты при тропических трепонематозах ( вызываемых T. pertenue, T. carateum и T.begeli ). Трепонемные тесты
образец сыворотки антитела к T.Pallidum антигены T. Pallidum контроли
антитела к IgG Щелочная фосфатаза Проведение теста : после отмывания добавление конъюгата (козьи антитела к IgG человека, меченые щелочной фосфатазой) и инкубация 30 мин при комнатной температуре. антигены T. Pallidum контроли
Субстрат BCIP изменение окраски антигены T. Pallidum контроли
отрицательный контроль положительный контроль положительный результат неопределенный результат отрицательный результат
Клиническая чувствительность - 100% Клиническая специфичность - 98% Воспроизводимость результатов - 100%
Разрешены к применению в РФ наборы реагентов ИХА, ИХЛА – иммунохемилюминесцентный анализ (CLIA – Chemiluminescence immune assay) « IMMULITE 2000 Syp » фирма « Simens » ( Германия ) Трепонемные тесты 0,09%
Стадия взаимодействия иммуносорбента (Tp17) с антителами, содержащимися в образце крови больного сифилисом, и антигеном Tp17, конъюгированным с ферментом Bead with Ag Tp17 IgG и IgM Ag Tp17 и фермент Стадия отмывания твердой фазы Активированное ферментом преобразование субстрата с выделением фотонов света Субстрат, содержащий адамантила диоксетан
Иммунохемилюминесцентный анализ Клиническая чувствительность – (до лечения ) Lues I n = 49 97,96 % Lues I I n = 11 6 100 % Lues latens n= 1 4 1 100 % Всего n= 306 99,68 % Клиническая специфичность - Здоровые доноры крови n= 60 96,67% Пациенты с БЛПР n=2 0 100% Всего n= 80 97,50 % Показания к применению : скрининговый и подтверждающий тест на сифилис в случае, если другие ТТ дают сомнительные или дискордантные результаты. Ограничения применения : требует существенных затрат на приобретение автоматического анализатора Трепонемные тесты
“ Abbott Determine TM Syphilis TP ” фирмы « Inverness Medical Japan Co., Ltd.», Япония ( РУ № ФЗС 2009/05498 ) “ ИммуноХром-антиТР-Экспресс ” фирмы ООО «МЕД-ЭКСПРЕСС ДИАГНОСТИКА», г. Москва, Россия ( РУ № ФЗС 2008/02303 ) “ ИХА-анти-ТП-ФАКТОР ” фирмы ООО «ФАКТОР-МЕД», г. Москва, Россия ( РУ № ФСР 2007/01604 ) Разрешены к применению в РФ наборы реагентов Трепонемные тесты ИХрА – иммунохроматографический анализ ( Ро int of care test) 0%
ОПИСАНИЕ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ 1 этап Получение образца биологического материала для проведения иммунохроматографического исследования 2 этап Проведение иммунохроматографического исследования 3 этап Учет результатов исследования Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Антиген Tp + частицы коллоидного Se или Au Антитело
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au ) и антитело человека
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au ) и антитело
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au ) и антитело
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Иммунный комплекс антиген Tp (+ частицы коллоидного Se или Au ) и антитело Y
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Иммунный комплекс антиген Tp ( + частицы коллоидного Se или Au ) и антитело Y Y антиген Tp, линейно фиксированный на твердой фазе
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Сложный иммунный комплекс Y Y
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Сложный иммунный комплекс Y Y
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Сложный иммунный комплекс Y Y
Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе Трепонемные тесты Y Y Y тест контроль
тест контроль тест тест контроль положительный результат исследования отрицательный результат исследования Трепонемные тесты Принцип проведения исследования на иммунохроматографическом стрипе
xMAP (проточная флюорометрия ) использует суспензию гранул (микросфер) диаметром 5,6 мкм каждый вид микросфер имеет уникальную спектральную характеристику (за счет комбинации внутренних красителей красного и инфракрасного спектра), что позволяет использовать до 100 различных микросфер в одном исследовании ( мультиплексный анализ ) Технология xMAP (Multiple Analytes Profiling)
поверхность микросфер одного типа покрыта одним видом специфического антигена T.pallidum при добавлении исследуемого образца к суспензии микросфер антитела связывается с соответствующей микросферой внесение детектирующего агента (конъюгаты, содержащие флуоресцентную метку) Технология xMAP (Multiple Analytes Profiling)
Проточная система 2 типа лазеров возбуждают флуоресцентные красители красный лазер - для классификации типа микросфер зелёный лазер - для получения количественного результата исследования Технология xMAP (Multiple Analytes Profiling)
Технология xMAP (Multiple Analytes Profiling) Наборы реагентов для xMAP (для исследовательских целей) The BioPlex ™ 2200 Syphilis IgG kit ( Тр15, Тр17 и Тр47 ) позволяет получать результаты раздельного определения антител класса G The BioPlex ™ 2200 Syphilis IgM kit ( Тр15 и Тр47 ) позволяет получать результаты суммарного и раздельного определения IgM BioPlex200 (Bio-Rad) BioPlex2200 (Bio-Rad) Luminex100 (Luminex)
Иммуночип – это современная технология, используемая в молекулярной биологии и медицине иммуночип - небольшой участок поверхности твердого носителя, на котором с большой плотностью в определенном порядке нанесены антигены T. pallidum ) Иммуночип, разработанный в ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России представляет собою микроскопный слайд, поверхность которого разделена на 12 одинаковых участков – эрреев, каждый содержит комплекс наиболее специфичных и иммуногенных антигенов T. pallidum ... К- К- (4) К+ К+ Tp 17 Tp 17 Tp 41 Tp 41 Tp 44.5 Tp 44.5 Tp 4 7 Tp 4 7 Tp 15 Tp 15 Tp 4 2 Tp 42 КЛ КЛ (21) К- К- (24) Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах
монтаж микроскопных слайдов в кассете-держателе Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах
внесение в лунки образцов биологического материала Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах
удаление реагентов из лунок на микроскопном слайде Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах
учет результатов исследования на спектрофотометрическом ридере Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах )
Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах ) представление результатов исследования и их интерпретация
на предприятии ЗАО « ЭКОлаб » разработана технология исследования в формате иммуночипа, при которой рекомбинантные антигены бледной трепонемы наносят на дно полистиролового иммунологического планшета; особенностью исследования является использование для выявления на твердой фазе ( иммуносорбенте ) формирующихся иммунных комплексов по технологии ФОСФАН, при которой регистрируется иммунофосфоресфенция ; особенностью технологии является возможность длительного сохранения результатов исследования и повторного снятия показателей с носителя. Технология исследования в формате микрочипа в лунках иммунологического планшета
исследование на иммуночипах позволяет определять присутствие антител разных классов дифференцировано к разным антигенам T.pallidum ; требуется небольшое количество образца биологического материала (10-50 мкл); общая длительность исследования не превышает 2,5 часов; результат оценивается по двум параметрам: качественный - специфические антитела определены или нет; полуколичественный - по интенсивности сигнала возбужденной люминесценции или фосфоресценции. Технология исследования в формате микрочипа на микроскопных слайдах )
проведение скрининга на сифилис (ИФА, РПГА, ИХЛА, ИХрА ), в особенности в популяциях с низкой превалентностью сифилиса; у лиц с соматической патологией, имеющих положительные результаты в НТТ, результаты исследования в ТТ позволяют выявить ложные положительные результаты серологического обследования в НТТ; подтверждение положительных результатов, полученных при скрининге с использованием таких высокочувствительных и высокоспецифичных ТТ как: ИФА, РПГА, ИХрА, РИФ abc /200, РИБТ и ИБ. Трепонемные тесты
Скрининг населения с целью выявления сифилиса с применением НТТ (РМП, RPR и их аналоги) Отрицательный результат Положительный результат Окончание обследования Положительный результат Отрицательный результат Трепонемный тест (ИФА, РПГА, ИХЛ, РИФ, РИТ ) Клиническое обследование для установления клинической формы активного сифилиса По клиническим показаниям БЛПР, обследование целью выявления причин
Тестированию c целью скрининга на сифилис с помощью данного алгоритма подлежат: лица в период общего диспансерного медицинского наблюдения; пациенты при госпитализации в медицинские учреждения; лица, в прошлом перенесшие сифилис и состоящие под клинико-серологическим наблюдением (с сохраняющимися положительными результатами исследований крови на сифилис в трепонемных тестах).
Скрининг населения с целью выявления сифилиса с применением ТТ (ИФА, РПГА, ИХГ, ИХЛ) Отрицательный результат Положительный результат Окончание обследования Положительный результат Отрицательный результат Нетрепонемный тест (РМП, RPR, VDRL) Клиническое обследование для установления диагноза (клинической формы активного сифилиса ) По клиническим показаниям Продолжение обследования: р анний сифилис ложная позитивность уточнение анамнеза: перенесенный сифилис
Тестированию c целью скрининга на сифилис с помощью данного алгоритма подлежат: лица, изъявившие желание стать донорами; пациенты при госпитализации в медицинские учреждения; пациенты кожно-венерологических учреждений с подозрением на ранний сифилис, в том числе с отрицательными результатами обследования прямыми тестами (ТМП, ПЦР); лица, в прошлом перенесшие сифилис и состоящие под клинико-серологическим наблюдением (с сохраняющимися положительными результатами иммунологических исследований крови на сифилис).
80% 5% 93% 32% 39% 88% 95% 63% 5% 19% Доля лабораторий, применяющих диагностический метод 2013 год
РМП-42,4% РПГА-11,1% ИФА-23,7% РСК-15,6% RPR-5, 4 % ПЦР-0,004% ИБ-0,007% РИТ-0,09% РИФ-1,5% Доля исследований каждым методом в общей структуре выполняемых исследований 2013 год
Перспектива развития трепонемных и нетрепонемных тестов для лабораторной диагностики сифилиса в мире и в Российской Федерации Трепонемные и нетрепонемные тесты
иммунохроматографический тест для одновременно определения антител к трепонемоспецифическим антигенам и кардиолипину перспективные направления исследований Control 1 2
иммунохроматографический тест для одновременно определения антител к трепонемоспецифическим антигенам и кардиолипину перспективные направления исследований Control Line Treponemal Cardiolipin Reactive Treponemal Pos Cardiolipin Pos Reactive Treponemal Pos Cardiolipin Neg BFP Treponemal Neg Cardiolipin Pos Non-Reactive
отечественные производители продолжают разработки и регистрацию с целью производства в России новых наборов реагентов для диагностики сифилиса; разработаны технологии выявления трепонемоспецифических антител класса M и G в ИБ в РИФ абс перспективные направления исследований
Проблемы диагностики сифилитической инфекции Динамика антителообразования при сифилисе 1 2 3 5 4 6 7 8 9 1 2 3 4 10 20 30 40 Инкубацион - ный период Сифилис I Серонегатив - н ый Сифилис I Серопозитив - ный недель лет Сифилис II Сифилис III Титры Антител Ig G (ИФА, РПГА, РИТ, РИФ) IgM (ИФА- IgM,РИФ, иммуноблоттинг ) РИФ - абс ИФА- IgM 19 SIgM-FTAabs
Ошибки в выполнении исследования связаны с нарушениями, допускаемыми на преаналитическом (50-70%), аналитическом (10-15%) и постаналитическом (15-25%) этапах исследования Ложноположительные и ложноотрицательные результаты, как правило, связаны с низким качеством применяемых диагностикумов, их невысокой чувствительностью и специфичностью, но могут быть обусловлены и другими «серологическими» причинами Несовпадение результатов исследований образца в разных диагностических тестах и в разных лабораториях Проблемы диагностики сифилитической инфекции
расхождение результатов объясняются особенностями синтеза антител различных классов на различных этапах развития инфекционного процесса; ввиду разного состава используемых в тесте антигенов (цельная клетка T. pallidum, ультраозвученный трепонемный антиген, химерные полипептиды – аналоги антигенов T. pallidum ) разная природа исследуемых антигенов (в РИФ - антитела к антигенам полисахаридной природы, в реакциях с кардио-липиновым антигеном – антифосфолипидные иммуноглобулины, в ИФА - антитела к антигенам белковой природы) избыток антител в сыворотке крови больного, что обусловливает конкуренцию антител с разной валентностью за сайты связывания с антигеном и блокаду антигенных детерминант, что проявляется «феноменом прозоны » нарушение иммунного ответа у больных ВИЧ недостаточная (различная) чувствительность наборов реагентов или диагностикумов «Серологические» причины расхождения результатов исследований в разных реакциях:
комплексное использование серологических НТТ и ТТ тестов с разным принципом выявления антител проведение полуколичественной оценки содержания реагиновых антител путем последовательного разведения образца, показавшего любую степень позитивности применение в качестве подтверждающих тестов других трепонемных методов исследования, основанных на определении иного типа антител, другого метода их идентификации или дифференцированного определения антител к разным антигенным детерминантам тщательный сбор анамнеза и учет результатов обследования на наличие других инфекционных заболеваний, таких как ВИЧ и вирусные гепатиты человека применение тестов с более высокой чувствительностью Пути решения «серологических» причин расхождения результатов лабораторных исследований
автоматизация процесса диагностического исследования объективизация учета результатов исследований применение технологий архивирования результатов исследования
Нормативная база лабораторной диагностики сифилиса источники: сайт Министерства здравоохранения РФ; информационные банки КонсультантПлюс, Гарант и другие источники: сайт ФГБУ «ГНЦДК» Минздрава России www. cnikvi.ru сайт РОДВК www.rodvk.ru
Методическая литература для лабораторной диагностики сифилиса источники: сайты производителей диагностических наборов реагентов ЗАО ЭКОлаб www. ecolab.ru
специалисты КЛД и дерматовенерологи имеют в своем арсенале богатый выбор методик и разрешенных к применению наборов реагентов для выявления в образцах крови пациентов специфических Ab к Ag возбудителя сифилиса, в том числе: - суммарно Ab всех классов; - дифференцированно класса М или G; - дифференцированно к наиболее специфичным Ag ; разработаны алгоритмы обследования населения для выявления больных сифилисом, основанные на применении на начальном этапе как НТТ, так и ТТ; разработки и предложения современных лабораторных тестов зачастую опережают клиническую оценку результатов для определения отдельных показателей здоровья пациентов.
ФГБУ «Государственный научный центр дерматовенерологии и косметологии» Минздрава России Вопросы ? контакты по электронному адресу: svrotanov@mail.ru ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России
