1.Молекулярлы тор хроматографиясы. 2.Белоктардың ионалмасушы хроматографиясы. 3.Жоғары тиімді сұйықтықты хроматография. 4.Газ сұйықтықты хроматография. Қарастырылатын сұрақтар:
Хроматография - бір - біріне қатысты араласпайтын және қозғалатын фазалар жүйесіндегі олардың қозғалу жылдамдығының айырмашылығына негізделген заттар немесе бөлшектер қоспаларын бөлу әдісі. Баған - құрамында хроматографиялық сорбент бар, қоспаны жеке компоненттерге бөлу функциясын орындайды. Элюент - жылжымалы фаза ( еріткіш немесе еріткіш қоспасы ): газ, сұйықтық немесе ( сирек ) суперкритикалық сұйықтық. Стационарлық фаза — адсорбциялық хроматографияда инертті тасымалдаушыда байланысқан қатты фаза немесе сұйықтық -сорбент. Хроматограмма -бағаннан шығатын компоненттердің концентрациясының уақытқа тәуелділігін тіркеудің нәтижесі. Детектор - бағаннан шығатын қоспаның құрамдас бөліктерінің концентрациясын тіркеуге арналған құрылғы. Хроматограф - хроматографияны жүргізуге арналған аспап. Термин сөздер:
Хроматографияның бұл ə дісі 1959 жылы пайда болып, қазіргі заманғы биохимияда Д. Порат ж ə не П. Флодин кезінде енген болатын. Бұл ə діс өте жаңа болғанмен, биохимиктер мойындап, қолданысқа ие болып отыр. Қазіргі кезде көптеген зерттеулер бұл ə діссіз жүзеге аспайды. Молекулярлы тор хромотографиясы әдісі
Молекулярлы тор хроматографиясы
Ксерогельдер – үш өлшемді полимер тізбектерінен гель бөлшектерін түзетін органикалық полимерлер. Яғни гель полимер тізбектерінің гидратацияланған үш өлшемді торынан тұрады. Құрамында еріткіші бар. Аэрогельдер сұйық фаза болмағандықтан, гельдерге жатпайды. Аэрогельдер өте ірі саңылаулары бар ж ə не үлкен арнаулы бағанды адсорбцияға ие. Аэрогель мен ксерогель гибридтері басқа да гель типтерімен ұқсас келеді. Бұл гельдердің полимерлері матриксі сольватацияға аз қатысатын, жартылай қатты құрылымдардан құралған. Ксероаэрогельдердің гибриді – хроматография үшін макроретикулярлы полистерді тасымалдаушы.
Гельдер тобындағы құрылымдық ерекшелік бірінші кезекте олардың еріткішке қатынасында болып табылады. К серогельдер қатты үрленген, солватирленген, компрессияға аз тұрақсыз гель береді.Сондықтан оларды ə ртүрлі молекулалық салмағы бар заттарды фракциялауға қолданады. Барлық типтегі гельдер саңылау құрылымды болғандықтан, ə р көлемдегі молекулалар, ə ртүрлі мөлшердегі гель саңылаулары гель бөліктерінің ішкі бөлімінде диффузия үдерісі жүреді, ол көлемі жағынан тек гель бөлшектерін қоршап тұрған ерітінді көлемімен қозғала алады. Н ə тижесінде, кіші молекулалар үлкендерге қарағанда ұзақ жолдан өтеді, бағаналарда ұсталып қалады.
Гель енгіш хроматографияның маңызды қасиеті бағананың барлық ерітіндісінің көлемін ж ə не ерітіндідегі гель арасынан бөлінген молекулалардың араласуын көрсететін тарату коэффициенті бо лып табылады. Үлкен мөлшерде, еркін көлемде енетін молекулалар геларалық фазалардың көлемінің коэффициенті нөлге тең болады, ал гельдің барлық саңылауларына енетін ұсақ молекулалар коэффициенті 1-ге тең. Мұндай сандық көрсеткішті коэффициенттер молекулалық салмағымен ерекшеленетін заттарды бөлуде, мысалы, белоктардың ірі молекулаларын тұзсыздандыруда байқалады. Мұнда молекуланы бөл i кшеде да орналастыру коэффициенті 0-ден 1 м аралықта жүреді. Бұл гель енгіш хроматографияны белоктардың молекулалық салмағын анықтауға мүмкіндік береді.
Ионалмасушы хроматография негізінде ионалмастырғыш, зарядталған топтар мен белокты глобула бетіндегі теріс белгінің зарядталған радикалдар арасындағы көптеген электростатикалық байланыстар орнатылады. Байланыс күші ə серлесетін зарядтардың с ə йкестігіне, олардың санына ж ə не белок зарядының ортақ жалпы мөлшеріне т ə уелді болады. Белоктардың ə ртүрлі изоэлектрикалық нүктелері болғандықтан, олар ионалмастырғыштың байланысу деңгейі бойынша ерекшеленеді. Белоктардың ионалмасушы хроматографиясы
Белоктың ионалмастырғыш хроматографиясы Көптеген ионалмастырғыш түрлері бар, алайда белоктарды бөлу үшін тек кейбіреулері ғана жарамды, ионизация деңгейі бойынша ə лсіз зарядталған тобы ретінде диэтиламиноэтил (ДЭАЭ) немесе корбоксилметил (КМ) жатады. Белок хроматографиясы үшін мықты зарядталған топтарды қолданбайды, өйткені оларда белокты байланыстыру күштері ед ə уір болып келеді, ə рі элюция ( сұйылту ) үдерісі белок денатурациясын тудыратын ерекше қатаң шарттарды қолдануды талап етеді. Белок хроматографиясы үшін гидрофобты қасиеттері бар сорбенттерді қолданбайды, өйткені бұл жағдайда кенеттен су мен қатты дене бөлімінің беті жүзімді, онда белок қарқынды денатурациялаушы ə серлерге тартылады.
Белок хроматографиясы үшін целлюлозалы ионалмастырғыштарды 1956 жылы E. Петерсон мен Х. Собер ұсынған болатын. Дегенмен одан бері белок хроматографиясы үшін басқа да тасымалдаушы ионалмастырғыштар пайда болды. ДЭАЭ- мен КМ- целлюлозалы сорбенттер белоктарды тазалауда алдыңғы орынды алады, целлюлозалы тасымалдаушылардың артықшылығы : О лар « сефадекс » гелі негізіндегі ионалмастырғыштарға қарағанда көлемін аз өзгертеді, С онымен қатар целлюлозалы талшықтардың құрылымының қаттылығы талшықтар бетінде ғана белоктардың макроиондарының сорбциясын ескертеді, осылайша маманданбаған сорбция үдерістерін болдырмайды да, элюция кезінде ( recovery) ионалмастырғыштан белоктың толық қайтуын қамтамасыз етеді. ДЭАЭ- целлюлозалы карбоксильді топтары бар қышқыл теріс зарядталған белоктарды бөлу үшін қолданылады.
Целлюлозалы ионалмастырғыштарда тиімді жұмыс үшін, соған қарасты буферлік ерітіндіні қолдану керек. О нда ион алмасу үдерісіне қатыспайтын ж ə не ионалмастырғыштың функционалды тобымен ə рекеттеспейтін буферлік ионы болу керек, яғни ДЭАЭ-целлюлоза үшін ə лсіз негізбен түзілген буферлік ерітінділерді пайдалану керек. М ысалы : трис, имидозол, аммоний, триэтанол, т.б. А л КМ-целлюлоза үшін ацетатпен, фосфатпен, цитратпен ж ə не т.б. түзілген буферді қолдану керек.
Қарсы ион ретінде ДЭАЭ үшін хлор ионын, ал КМ-целлюлоза үшін натрий ионын қолданған жөн. Олармен тұзды формаларды зарядталған ионалмастырғышпен ауыстыру керек, бұл зарядталған ионалмастырғышты сорбциялауды ескертеді, осылайша маманданбаған сорбция үдерісін болдырмайды. Элюция кезінде ( recovery) ионалмастырғыштан белоктың қайтуын қамтамасыз етеді. ДЭАЭ- целлюлозалы карбоксильді топтары бар қышқыл теріс зарядталған белоктарды бөлу үшін қолданылады. Мысалы, ДЭАЭ- целлюлозалар трис -НС l буферінің көп көлемімен шайылады, бұл элюент рН-ы ша - ятын буфер рН- ына тең болғанша жүргізіледі. Тек осыдан кейін ғана ионалмастырғыш жұмыс істеуге даяр болады.
Ақырында, ионалмастырғышты сүзумен немесе бейтарап рН эле- ментке дейін су деионтациясымен жуады. Осылайша, қолданылған ионалмастырғыштарды көбірек қалпына келтіруге болады.КМ -целлюлоза үшін зарядтың жүру т ə ртібі керісінше болады. Алдымен сілтімен өңдеу, содан соң шайылғыш элюент рН- ын 8,0-ге дейін жеткізу ж ə не соңында НС l- мен өңдеу, бейтарап реакцияға дейін жуу. ДЭАЭ- целлюлозамен жұмыс жасағанда, ионалмастырғыш ауданы көмірқышқыл газымен ə серлеспеуі керек, ДЭАЭ топ газбен ДЭАЭ- карбонаттар мен бикорбонаттар түзеді, бөлінуді кенет өзгертуі ж ə не ə дістің орындалуын бұзуы мүмкін. Мұны болдырмау үшін гель мен барлық ерітінділердіні ауасыздандыру ( дегаздау ) керек.
Толтырылған бағананы бастапқы буфермен шаяды да, үлгіні жағады, сосын элюцияны бастапқы буфермен жалғастырады ( онда белок ерітілген ). Жиналған фракцияларда белок құрамын анықтайды, элюцияны элюатта белок табылмайынша жалғастырады ; тек осыдан кейін ғана ионалмастырғышпен байланысқан белоктарды бөліп алу үшін ионды күштің біртіндеп немесе сатылы өсуімен немесе р H өзгеруі мен буфер ерітіндісінің градиентін ж ə не сатылы элюцияны қолдануға болады. Белокты қоспалардың тиімді бөлінуі үшін ұзын емес, қысқа бағаналарды пайдаланған дұрыс ж ə не үлкен көлемді жоғары градиенттерді беру керек. Сатылы элюцияда ə рбір сатыны белокты толығымен алғанша жүргізу керек, содан кейін ғана оны келесі сатыға бере аламыз. Дайын гельді жағу техникасы
Ионалмасушы хроматография кезінде белок элюциясының үздіксіз бақылануы қажет, спектрдің ультракүлгін бөлігіндегі элюат экстинкциясының автоматты тіркеуін мүмкіндігінше пайдалану керек. Бөлу үдерісінің аяқталуынан кейін қайта қолдану үшін бағананы NACl 1 M ерітіндісімен алады да, бастапқы буфермен теңестіреді. Ионалмастырғышты пайдалану мөлшеріне қарай үстіңгі қабатты қайтымсыз байланысқан заттармен біртіндеп шешіп алады. Бағананы тазарту үшін, NACl - дың қаныққан ерітіндісімен жуады, шаяды.
Кейбір жағдайларда « батч » ə дісі, қарапайым ионалмастырғышты қосып, белокты өңдеу қолданылады, 1 сағат араластырады да, ионалмастырғышты сүзу немесе центрифугалау арқылы жояды. Бұл жағдайда балласты белоктарды байланыстыру үшін ионалмастырғыш пайдаланылады.Целлюлозалы ионалмастырғыштан басқа, сефадекстер негізіндегі ионалмасушы сорбенттер қолданылады. «Фармация» (Швеция) фирмасы ДЭАЭ мен КМ – сефадекстердің А ж ə не С типіне с ə йкес анионды ж ə не катионды алмастырғыштармен белгіленетін түрлерін шығарады. Бұл фирма ДЭАЭ ж ə не КМ СЕ- G В сефарозаларды өндіреді, олар жоғары молекулалы белоктарды бөлуге өте ыңғайлы, ионды емес детергенттер кезінде де жұмыс жасауға қабілетті. Батч әдісі
күрделі құрамды органикалық үлгілерді бөлудің тиімді ə дістерінің бірі болып табылады. Хроматографиялық бөлудің негізі бөлінетін қоспа бөлшектерінің фазалар бөлімдерінің аймағында Ван-дер- Вальстік ə рекеттесулердің күрделі жүйесіне қатысуы болып есептеледі. Жоғары тиімді сұйықтықты хроматография (ЖТСХ)
ЖТСХ- ның негізгі бір ерекшелігі – жоғары қысымды қолдану. Элюентті өткіздіру үшін 3,107 Па- ға дейін қысым қолданылады (оны басқаша жоғары қысымды хроматография деп атайды, 400 бар- ға дейін.
ЖТСХ-да кішкентай мөлшерлі бөлшекпен (3-10 мкм, қазір 1,8 мкм- ге дейін ), ұсақ д ə нді сорбентпен тығыздалып қапталған 5 мм- ге дейінгі диаметрі бар бағаналар қолданылады. Бұл заттардың күрделі қоспаларын жылдам ж ə не толық бөлуге мүмкіндік береді ( талдаудың орташа уақыты 3-тен 30 минутқа дейін ). ЖТСХ- ның нұсқалары – бұл кіші диаметрлі бағаналарға толтырылған микробағаналы хроматография ж ə не қуыстарға сорбенттер толтырылған тамшылы бағаналарды тамшылы хроматография ( капиллярлы хроматография) арқасында пайдаланады.
Талдау т ə сілі ретінде ЖТСХ- зерттелетін үлгінің күрделілігіне қарай негізгі күрделі қоспаны қарапайым қоспаға бөлетін ə дістер тобының қатарына кіреді. Алынған қарапайым қоспалар талданады, содан кейін қарапайым физикалық-химиялық ə дістермен немесе хроматография үшін жасалған арнайы ə дістермен ары қарай талданады.
2.5-сурет. Белоктарды тазалау үшін жоғары тиімді сұйықтықты ионалмасушы хроматографиясының (ЖТСХ) типтік орнатылуы. Үлгіні жүктемеден кейін ( екпе ине көмегімен ) үлгіні элюциялау үшін сорғыш арқасында тұздың градиентін құрайды
Айта кететін жайт – бұл т ə жірибелік жұмыста бөлу бір-бірден емес, бір уақытта бірнеше механизммен жүргізіледі. Сонымен, эксклюзиялық бөліну адсорбциялық тиімділік пен адсорбциялық-таратушы ж ə не керісінше күрделенген болуы мүмкін. Сонымен қатар үлгіде ионизация, молекулалық массасы бойынша, негіздік ж ə не қышқылдық деңгейі бойынша, поляризациялануы немесе басқа параметрлері бо - йынша заттардың айырмашылығының неғұрлым көп болуы бұл заттар үшін бөлінудің басқа механизмдерінің шығуына соғұрлым мүмкіндік туғызады.
Іс жүзінде кең таралған хроматография бұл « айналмалы фазалық » хроматография ( таратушы ) болып табылады, мұнда қозғалыссыз фаза полярлы емес, ал қозғалмалы полярлы ( яғни, керісінше, «тура фа-залы » хроматография). Сұйықтықты хроматографияның принципі қоспа бөлшектерін бөлу болып табылады ж ə не бұл, негізінен, олардың екі араласпайтын фаза арасында тепе- тең тарату айырмашылығына негізделген. Бұл фазалардың біреуі – қозғалыссыз, ал екіншісі – қозғалмалы.
Үлгіні талдау үдерісі екі кезеңге бөлінеді : 1. Үлгілерді құрастырушы бөлшектерге бөлу. 2. Ə рбір бөлшектің құрамын детектрлеу ж ə не өлшеу.Бөлу хроматографиялық бағаналар көмегімен орындалады, яғни бұлбағаналар сорбентпен толтырылған түтікшелер арқылы ұсынылады. Хроматографиялық бағана арқылы талдауды жүргізу кезінде белгілі құрамды сұйықтықты тұрақты жылдамдықпен береді. Осы ағымға үлгінің нақты, тура өлшенген мөлшерін енгізеді.Хроматографиялық бағанаға енгізілген үлгілердің құрамдас бөл i ктері олардың сорбенттерге ə ркелкі туыстықтарының арқасында бағаналар онда ə ртүрлі жылдамдықпен жылжиды ж ə не ə ртүрлі уақыт кезеңінде детекторға жетеді.Сөйтіп, хроматографиялық бағана бөлшектерінің бөлінуінің селективтілігіне ж ə не тиімділігіне жауап береді. Бағаналардың ə ртүрлі тұрпатын таңдай отырып, талданатын заттардың бөліну деңгейін басқаруға болады.
