ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №9 Частная микробиология Для студентов ОмГМА
Ознакомить студентов с возбудителями особо опасных, природноочаговых антропозоонозных инфекций и современными методами их микробиологической диагностики.
Семейство Enterobacteriaceae Род Yersiniae Род включает 11 видов. В патологии человека основное значение имеют 3 вида: Y. pestis - вызывает чуму, Y. pseudotuberculesis - псевдотуберкулез, Y. enterocolitica - (кишечный) иерсиниоз, Ряд видов - непатогенные или условно – патогенные иерсинии для человека.
Чума (возбудитель Y. pestis ) – острая инфекционная природнооча говая болезнь, относящаяся к группе карантийных (конвенционных) инфекций, характеризующаяся тяжёлой интоксикацией, лихорадкой, поражением кожи, лимфатических узлов лёгких, сепсисом и высокой летальностью.
Возбудитель открыт в 1894г. А.Иерсеном совместно с С.Китасато. Известно 3 пандемии чумы: Первая пандепия «юстинианова чума» - VI век (Ближний Восток, Европа) - вызвала гибель 100 млн человек; Вторая пандемия «чёрная смерть» - XIV век (занесена в 1348 г. из Азии в Европу) - вызвала гибель более 50 млн. человек; Третья пандемия – XIX век (началась в 1894 г. в Кантоне и Гонконге, охватывала только портовые города.
Природные очаги чумы существуют на всех континентах кроме Австралии и Антарктиды. Регистрируются ежегодно до несколько сотен случаев В России очаги в регионах Закавказья, Поволжья.
Резервуар возбудителя – дикие синантропные и домашние животные (около 300 видов) Основные носители – грызуны (сурки суслики, полёвки, крысы, зайцы и др.), у которых чума в зимней спячке протекает в хронической латентной форме. Они являются источником инфекции в межэпидемический период. Обнаруживается в географических зонах между 35 0 северной широты и 35 0 южной широты, где источники и хранители возбудителя – домовые виды крыс и мышей, от которых заражаются домашние животные.
Специфический переносчик возбудителя – блохи Человек в очагах заражается: трансмиссивно – через укусы инфицированных блох; контактным путём – при разделке шкур, мяса; алиментарным путём – с заражёнными продуктами; аэрогенным путём – от больных легочной формой. Восприимчивость людей к чуме очень высока. Индекс контагиозности приближается к единице.
Грамотрицательные палочки, чаще имеют овоидную (кокко-бациллярную) форму, склоны к полиморфизму. Окрашиваются анилиновыми красителями биполярно. Большинство видов иерсиний подвижны (имеют перитрихиальные жгутики) при температуре ниже +30 градусов С. Y. pestis – неподвижны при +30 0 С, имеют капсульное вещество. Другие виды иерсиний имеют капсулу.
Факультативные анаэробы. Температурный оптимум от +25 до + 28 градусов С, pH - близкая к нейтральной. Хорошо культивируются на простых питательных средах. Ферментируют большинство углеводов без образования газа. Иерсинии способны менять свой метаболизм в зависимости от температуры и размножаться при низких температурах ( психрофильные свойства ). Вирулентные штаммы образуют шероховатые ( R ) колонии, переходные ( RS ) и сероватые слизистые гладкие ( S ) формы.
Стадии роста Y. pestis на плотных питательных средах (СБТС, Туманского, Серова, Эндо, Мак-Конки, МПА): I стадия «битого стекла» – через 8-12 часов II стадия «кружевных платочков» - через 18-20 часов III стадия «ромашки» - через 24 – 48 часов На жидких питательных средах (МПБ) образуют плёнку, от которой спускаются вниз нити «сталактиты», на дне – хлопьевидный осадок.
Y. pestis обладает антигенной структурой: О- Ag - термостабильный (имеют общие Ag с эритроцитами О - группы крови человека) Н- Ag - термолабильный F1-Ag – протективный продуцируется при температуре 37 градусов, препятствует поглощению микроба фагоцитами, детерминируется – pFra -плазмидой V-Ag (пептид) и W-Ag (внеклеточный полипротеин) обеспечивают способность бактерий сохраняться в фагоцитах
Y. pestis с интезирует ферменты : Плазмокоагулазу Фибринолизин Гемолизин Лецитиназу РНК-зу Пестицин
Y. pestis обладает тремя плазмидами: р Pst – детерминирует синтез фибринолизина и плазмокоагулазы pCad - детерминирует синтез V-Ag и W-Ag pFra – детерминирует синтез F1-Ag, препятствует поглощению микроба фагоцитами
Необходимые для идентификации: Не разжижает желатин Не расщепляет мочевину Не ферментируют рамнозу и сахарозу Ферментирует декстрин По отношению к утилизации глицерина подразделяется на хемовары
Зависят от пути заражения: При контактном пути: 1. КОЖНАЯ форма: Первичная бубонная – заражение через кожу Генерализованная – при утрате лимфоузлом барьерной функции Вторичная бубонная форма Гематогенный занос микробов в лёгкие может привести к Вторично-легочной форме
При воздушно-капельном заражении: 3. Первично-легочная форма При алиментарном заражении: 4. Кишечная форма
Иммунитет различный по длительности и напряжённости. В основном клеточный (макрофагальный) Отмечаются повторные заражения
Применяется в очагах чумы. Используется живая ослабленная вакцина из штамма EV. Имеется сухая таблетированная вакцина для перорального применения. Для оценки иммунитета к чуме (естественного постинфекционного и вакцинального) может применяться внутрикожная аллергическая проба с пестином.
Псевдотуберкулёз (возбудитель - Y. pseudotuberculesis ) – инфекционное заболевание, характеризующееся полиморфностью клинической картины с поражением мезентериальных лимфоузлов, затяжным течением, аллергизацией организма с развитием ГЗТ.
Возбудитель - Y. pseudotuberculesis впервые описан в 1883г. Л.Маляссе и В.Виньялем. Резервуар возбудителя в природе – многие виды млекопитающих, птицы, грызуны, вода, почва. Пути передачи – водный, алиментарный Факторы передачи – вода и овощи. Заражение человека от больного или носителя – не происходит.
Болезнь распространена повсеместно Возникает в виде спорадических и эпидемических вспышек Характерна сезонность: февраль – март. На Дальнем Востоке протекает в виде эпидемических вспышек в генерализованной форме под названием Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка.
Кишечный иерсиниоз (возбудитель - Y. enterocolitica ) - инфекционное заболевание с поражением тонкого и толстого кишечника и развитием мезентериального лимфоденита
Возбудитель - Y. enterocolitica описан Дж. Шлейфстейном и М.Калеманом в 1939г. Заболевание стало широко распространяться с конца 1960 годов Антропозооноз Выявляется во всех странах Возникает в виде групповых, семейных и внутрибольничных вспышек Резервуар в природе – почва, вода, растения. Резервуар и источник инфекции – домашние животные и птицы. Основные пути передачи – водный и алиментарный (через воду, молоко, овощи) Может передаваться от человека к человеку
ИМ Экспресс-методы: - РИФ - ИФА - ПЦР - Латекс-агглютинация - Ко-агглютинация - РТП – Реакция термопреципитации по Асколи для выявления соматического антигена МПБ МПА СБТС, Эндо Туманского Серова Мак-Конки 28 0 С / 24 - 48час R, S, RS - формы I ст. «битого стекла», (10 – 12 час) II ст. «кружевных платочков» (18-20 час) III ст. «ромашки» (24-48 час) МПА Чистая культура Биопроба: На мышах, морских свинках или кроликах Мазки-отпечатки из органов погибших животных На предметные стёкла На питательные среды МПА МПБ СБТС, Эндо Серова Туманского Мак-Конки РИФ, ПЦР, ИФА, Ферментативная активность: лецитиназа (+) гемолиз (+) фосфотаза (-) плазмокоагулаза (+) оксидаза (+) Каталаза (+): Биохимическая активность: сахароза (-), глюкоза (+), мальтоза (+), рамноза ( - ), мочевина (- ) индол (-), эскулин и декстрин (+) подвижность при 28 град ( - ). VP ( - ). 5%КА ФФФ натрия Н 2 О 2 Чув к А/б ЖМСА Чув к фагу Серологические методы на Ag – РА, РНГА Защелачивание 0.5%NaCl и 40% KOH Забуфер. Физр-р Грам-пал
Возбудитель сибирской язвы - Bacillus anthracis Семейство Bacillaceae (бациллы) Род Bacillus
Крупная грамположительная палочка, с закругленными или чаще с обрубленными концами. На средах возбудитель образует длинные цепочки в виде “ бамбуковой трости ” (с утолщениями на концах и сочленениями клеток). В отличие от других бацилл – неподвижна Хорошо окрашивается анилиновыми красителями. В клинических материалах расположены парами или в виде коротких цепочек, окруженных общей капсулой Капсула образуется только в организме человека и животных или на специальных средах с кровью, сывороткой крови.
Возбудитель сибирской язвы образует эндоспоры, которые располагаются центрально, их диаметр не превышает диаметра бактериальной клетки. Споры образуются только вне организма, при наличии (доступе) кислорода и определенной температуре (от +12 до +43о С, оптимум при 30-35о С). Споры проявляют очень высокую устойчивость во внешней среде (десятилетия). Сибирская язва - почвенная инфекция.
Возбудитель растет в аэробных и факультативно - анаэробных условиях. Температурный оптимум +37 о С, рН - 7,2 - 7,6. Растет на простых питательных средах, в т.ч. на картофеле, настое соломы, экстрактах злаковых и др. Дает характерный рост при посеве уколом в желатин (“ перевернутая елочка ”). Вирулентные R - формы на плотных средах образуют шероховатые серовато - белые колонии волокнистой структуры (“ голова медузы ” или “ львиная грива ”). На средах образует длинные цепочки в виде “ бамбуковой трости ” (с утолщениями на концах и сочленениями клеток).
На агаре, содержащем пенициллин, происходит разрушение клеточных стенок, образуются шаровидные протопласты в виде цепочек (“ жемчужное ожерелье ”). На жидких средах образуется осадок в виде комочка ваты. Возбудитель сибирской язвы может образовывать также гладкие ( S ), слизистые (М) или смешанные ( SM ) колонии, особенно в микроаэрофильных условиях. В S - форме возбудитель утрачивает вирулентность.
B. anthracis биохимически высоко активна Ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, трегалозу Образует сероводород Свертывает и пептонизирует молоко.
Выделяют три основных группы антигенов - капсульный антиген, соматические антигены, токсин (кодируются плазмидами, при их отсутствии штаммы авирулентны). Капсульные антигены отличаются по химической структуре от К - антигенов других бактерий, полипептидной природы, образуются преимущественно в организме хозяина. Соматические антигены - полисахариды клеточной стенки, термостабильны, долго сохраняются во внешней среде, трупах. Выявляют их в реакции термопреципитации Асколи. Токсин включает протективный антиген (индуцирует синтез защитных антител), летальный фактор, отечный фактор.
- капсула и токсин.
Сибирская язва - зоонозная инфекция. Основной источник для человека - травоядные животные. Животные заражаются происходит преимущественно алиментарным путем, споры длительно сохраняются в почве и заглатываются животными преимущественно с кормами, травой). Особую опасность представляют сибиреязвенные скотомогильники (в них споры длительно сохраняются, при их разрывании, размывании и других процессах попадают на поверхность почвы и растения). Человек заражается при контакте с инфицированным материалом (уход за больными животными, разделка и употребление в пищу инфицированных мясных продуктов, контакт со шкурами сибиреязвенных животных и др.).
зависят от входных ворот инфекции: кожная (карбункул), кишечная, легочная, септическая. Характерна высокая летальность (меньше при кожной форме).
Материал для исследования от больных зависит от клинической формы. При кожной форме исследуют содержимое пузырьков, отделяемое карбункула или язвы, При кишечной - испражнения и мочу, При легочной - мокроту, При септической - кровь. Исследованию подлежат объекты внешней среды, материал от животных, пищевые продукты.
Бактериоскопический метод Окраска используется для обнаружения грамположительных палочек, окруженных капсулой, в материалах от человека и животных, спор - из объектов внешней среды: по Граму (Грам+), раствором Ребигера на капсулу (капсула красно-фиолетовая, тело – тёмно-фиолетовое), по Пешкову (спора- голубая, клетка – розовая). Препарат фиксируют 15 мин в жидкости:90% спирта 60мл+ хлораформа 30мл + уксусной эссенции 10 мл. Протравливают 2-5 мин в 10% водном растворе танина. Промывают водой, красят 30-60 сек фуксином Пфейффера и не промывая сушат и микровскопируют. синькой Лёфлера (тело – синее, спора – розовая). Чаще применяют метод флюоресцирующих антител (МФА ), позволяющий выявлять капсульные антигены и споры.
Бактериологический метод В лабораториях особо опасных инфекций по стандартной схеме проводятся посевы на простые питательные среды: МПА, МПА с пенициллином (тест «жемчужное ожерелье»), дрожжевая среда, среда ГКИ. Определяется подвижность (-), образование капсулы возбудителя в чистой культуре. Определяется ферментативная активность: каталазная (+), лецитиназная (-), гемолитическая (-), фосфотазная (-).
Бактериологический метод Изучается биохимическая активность на углеводах: сахароза (+), глюкоза (+), мальтоза (+), трегалоза (+), желатин (+ «перевернутая ёлочка»). Образование сероводорода (+), KNO 3 (+). Определяется способность свёртывать и пептонизировать молоко (+). Определяют лизабельность бактериофагами.
Бактериологический метод Определение капсулообразования 2 метода: In vitro : В среду Хенкса с 40% бычьей или лошадиной сыворотки (предварительно активированной при 56 0 – 30 мин) добавляют несколько капель испытуемого материала. Закрывают пробкой и помещают на 30 мин до 120 мин в термостат на 37 градусов для капсулообразования у культуры. Из материала делают мазки, окрашивают люмсыворотками для ИФМ (иммунофлюорисцентный метод). In vivo : биопроба на мышах с последующим получением чистой капсульной культуры из органов.
Биологическая проба Белые мыши погибают в пределах двух суток, Морские свинки и кролики погибают в течение четырех суток. Из органов погибших животных(лимфоузлы, селезёнка, печень, лёгкие, сердце, почки и из крови делают мазки-отпечатки. Мазки-отпечатки, обработанные смесью Никифорова окрашиваются: по Граму, по Романовского-Гимзе, люмсыворотками или иммунными сыворотками для РИФ, люммикроскопии.
Иммунологические и серологические методы РИФ ИФА ПЦР Латекс-агглютинация Ко-агглютинация РТП – Реакция термопреципитации по Асколи для выявления соматического антигена РНГА
ИМ Экспресс-методы: - РИФ - ИФА - ПЦР - Латекс-агглютинация - Ко-агглютинация - РТП – Реакция термопреципитации по Асколи для выявления соматического антигена МПБ МПА ГКИ 37 0 С / 24 - 48час R, S, М - формы «Голова медузы», «Львиная грива» (10 – 12 час) МПА Чистая культура Биопроба: На мышах, морских свинках или кроликах Мазки-отпечатки из органов погибших Животных, окраска по Романовского-Гимзе На предметные стёкла На питательные среды МПА МПБ РИФ, ПЦР, ИФА, Ферментативная активность: лецитиназа (+) гемолиз (+) фосфотаза (+) плазмокоагулаза (+) оксидаза (+) каталаза (+): Биохимическая активность: сахароза (-), глюкоза (+), мальтоза (+), крахмал (+), фруктоза (+) свёртывает молоко (+) желатиназа (+) сероводород (+), KNO 3 (+) 5%КА МПА с пеницил Н 2 О 2 Чув к А/б ЖМСА Лец+ Чув к фагу Серологические методы на Ag : РА, РНГА, Дрожжевая среда Тест «жемчужное ожерелье» Гр+пал
Реакция используется для обнаружения сибиреязвенного Ag. РТП используется при наличии струпов, несвежего материала, шкур, павших животных. Материалы для исследования: Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка Ag из испытуемого материала Сибиреязвенный бактерийный Ag для контроля
Схема постановки. Испытуемый материал Эк c тракт Ag : 1. ИМ 1 мл заливают 10 мл физ.раствора (1:10). 2. Полученную суспензию экстрагируют кипячением при 100 0 С – 5 -10 минут. Фильтруют через фильтры: Владипор, вата, асбестовые, фильтровальная бумага Экстракт Ag + к - к - к - к В узкие пробирки наливают: 0,2-0,3 мл С/Я сыворотки + 0,2-0,3 мл экстракт Ag Параллельно ставятся контроли «+» и «-»: 1. Преципитирующая сыворотка + экстракт из материала больного животного – «+» К 2. Преципитирующая сыворотка + экстракт из материала здорового животного – «-» К 3. Преципитирующая сыворотка + физ.раствор – «-» 4. Нормальная сыворотка + исследуемый экстракт – «-» На границе через 15 минут появляется белое мутное кольцо. Реакция «+»
Определяются размеры зон задержки в мм (или отсутствие) роста культуры; Определяется минимальная подавляющая концентрация препаратов (МПК). На среде АГВ
Применяют противосибиреязвенный иммуноглобулин, антибиотики (пенициллины, тетрациклины и др.). Профилактика. Применяют живую споровую безкапсульную вакцину СТИ, протективный антиген.
