Доронина Татьяна Валерьевна 2019 год Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра клеточной биологии и гистологии
Предел разрешения светового микроскопа: 200-300 нм (0,2 – 0,3 мкм) 130-140 нм (0,13 – 0,14 мкм) – при использовании УФ света Предел разрешения электронного микроскопа : 1 Å (0,1 нм ) 1 мкм = 10 −6 м ; 1 нм = 10 −9 м; 1 Å = 10 −10 м
ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ ТРАНСМИССИОННАЯ МИКРОСКОПИЯ СКАНИРУЮЩАЯ МИКРОСКОПИЯ
1. Забор материала 2. Фиксация Кусочек ткани – не более 1-1,5 мм 3 2,5% глутаровый альдегид Альдегиды «сшивают» клеточные белки Глутаровый альдегид обеспечивает лучшую сохранность тонких структур + относительно быстро проникает в ткани. Буферы – Зоренсена, какоделатный pH 7,2-7,4
70 ° спирт 96 ° спирт 100 ° спирт ацетон Фиксатор 3. Постфиксация. При альдегидной фиксации ненасыщенные липиды и фосфолипипиды не стабилизируются – нужна дополнительная фиксация (« постфиксация »). 1 % раствор тетраоксида осмия ( OsO 4 ) - взаимодействует с липидами и беками по месту двойных связей. 6 0 ° спирт 50 ° спирт 1,5% раствор уранилацетата 5. Позитивное контрастирование 4. Обезвоживание
6. Пропитывание ткани заливочной смесью ацетон/ эпон =3:1→ ацетон/ эпон =1:1 → ацетон/ эпон =1:3 7. Заливка материала Эпоксидные смолы, эпон капсулы с заливочным эпоном → термостат 37° С → термостат в 60 ° С (полимеризация)
8. Резка материала на ультратоме электронный пучок не проникает сквозь срезы, толщина которых значительно превышает 100 нм ; в толстом срезе компоненты перекрывают друг друга и видны менее четко. → тонкие срезы 50-100 нм
сеточки бленды Помещение срезов на сеточки и бленды 9. Контрастирование ( уранилацетат, затем цитрат свинца по методу Рейнольдса )
Трансмиссионная электронная микроскопия фиксация глутаровым альдегидом – дает отличную сохранность тканей; промывка буфером; дофиксация четырехокисью осмия (+контрастирование ); 50 ° спирт; 60 ° спирт; 70 ° спирт с уранилацетатом ; 80 ° спирт; 96 ° спирт; 100 ° спирт; ацетон; ацетон:эпон =3:1; ацетон:эпон =1:1; ацетон:эпон =1:3; эпон (эпоксидная смола); 37 ° ; 60 ° ; затачивание пирамидки; изготовление ультратонких срезов 60-80 нм на ультрамикротоме; помещение срезов на бленды или сеточки с формваром ; контрастирование ( уранилацетат, затем цитрат свинца).
Трансмиссионная электронная микроскопия митохондрии митохондрия АГ ядро Позитивное контрастирование
Трансмиссионная электронная микроскопия Негативное контрастирование Контрастирование напылением металла круговое под углом
Негативное контрастирование Используют растворы солей тяжелых металлов ( уранилацетата, молибденокислый аммоний, фосфорно-вольфрамовая кислота – электронноплотные вещества) Объекты выглядят светлыми пятнами на темном фоне Плюсы Можно проникать вглубь объекта, выявлять дополнительные детали Минусы Плохо выявляются нитчатые молекулы из-за малой толщины
Метод напыления Для напыления используют металлы, характеризующиеся низкой степенью окисления, и их сплавы (золото, медь, алюминий, платина). Напыление производят в специальной вакуумной камере путем нагрева и испарения металла в вакууме или «выбивания» атомов металла в результате действия ионов инертного газа. Атомы испаряющегося металла покрывают тонкой пленкой поверхность образца. Если объект имеет сложную конфигурацию, и металл не поникает во все углубления, контрастирование производят путем напыления углерода. Напыленный на ткань металл называется репликой.
Холерный вибрион
Оттенение металлами К онтраст реплике можно создать, напыляя под острым углом электронноплотное вещество, например, тяжелый металл. Термическое испарение металла металла Атомы металла встречаются с объектом и осаждаются на нем в виде слоя Там, где объект экранирует пучок частиц – «тень» Минусы: Увеличение размеров объекта на толщину напыленного слоя Дает представление только о внешнем виде и форме частиц h = lxtgθ θ - угол напыления, l - длина тени, h - высота объекта
Микрококки
Сканирующая электронная микроскопия фиксация глутаровым альдегидом ; промывка буфером; 30 ° спирт; 50 ° спирт; 70 ° спирт; 80 ° спирт; 96 ° спирт; 100 ° спирт; 96 ° спирт:ацетон =3:1; 96 ° спирт:ацетон =1:1; 96 ° спирт:ацетон =1:3; ацетон; высушивание в критической точке; приклеивание образца к металлическому столику (лаком для ногтей); напыление (смесью Au - Pd (золото – палладий)).
Сканирующая электронная микроскопия Чистый продукт однослойных углеродных нанотрубок.
Замораживание-скалывание (травление) Пропитывание ткани криопротектором ( глицерин, ацетон, спирт, диметилсульфоксид, сахара, поливинилпирролидон, полиэтиленоксид ) Т кань подвергается быстрому замораживанию жидким азотом (-196°С ) Скол охлажденным ножом в специальной вакуумной установке В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола покрывается тонким слоем углерода, а затем металла ( Au, Cu, Pd ) При комнатном температуре ткань растворяют в кислотах, а реплика остается, ее смотрят в СЭМ
ТЭМ
СЭМ
ТЭМ
СЭМ
Замораживание-скалывание
СЭМ
ТЭМ
Замораживание-скалывание
Фазовый контраст – СВЕТОВАЯ микроскопия
