Определение типа электрофореграммы может подтвердить предполагаемый диагноз, выявить скрытую патологию, следить за ходом лечения Абсолютным показанием для исследования электрофореграммы является подозрение на миеломную болезнь, иммунодефицит. Может быть полезным -для диагностики заболеваний печени, нефротического синдрома, злокачественных новообразований, коллагенозов - при контроле течения заболеваний, при которых нарушается белковый состав сыворотки крови - при скрининге врожденного или приобретенного дефицита или аномалии белков - при снижении содержания общего белка < 60 г/л или повышении > 85 г/л, при снижении концентрации альбумина < 35 г/л и при увеличении СОЭ > 25 мм/час
Выявляется двойная полоса в зоне альбумина Может быть генетически обусловленной или транзиторной Причины: присутствие препарата, связанного с альбумином, заболевания поджелудочной железы (лизис ферментами )
Врожденная патология (встречается редко) Сочетается с гиперглобулинемией
Гипоальбуминемия Белковое голодание Нарушение всасывания в ЖКТ Нарушение синтеза белка Потери белка с мочой Повышение катаболизма белков
Снижение α 1 –глобулинов -заболевания печени -массивные кровопотери -нарушение питания дефиците α 1 –антитрипсина
Увеличение α 1 –глобулинов -острые воспалительные заболевания (увеличение концентрации α 1 –антитрипсина, орозомукоида)
Снижение α 2 –глобулинов Нарушение питания Патология печени Внутрисосудистый гемолиз Увеличение α 2 –глобулинов (преимущественно за счет гаптоглобина и α 2 -макроглобулина) Воспаление (сочетается с увеличением α 1 -глобулинов) Нефротический синдром
Уменьшение β - глобулинов -патология печени -дефицит С3-компонента комплемента Увеличение β - глобулинов Увеличение β - глобулинов -Гемолизированная сыворотка ЖДА (за счет трасферрина) повышение С3-компонента комплемента
Слияние β - и γ - фракции (за счет увеличения поликлонального Ig A )
Физиологическая – у новорожденных Первичный гуморальный иммунодефицит Вторичный – при лечении глюкокортикоидами, иммунодепрессантами, химиотерапии, радиотерапии
Диффузное усиление зоны γ - глобулинов (инфекционные заболевания печени, СПИД, аутоиммунные заболевания)
Появление нескольких полос (синтез в организме одновременно нескольких типов антител к различным антигенам) Накопление антител при системных ревматических заболеваниях
Появление узкой гомогенной полосы У пожилых лиц обнаруживается бессимптомная гаммапатия Встречается миеломе, лимфоме, хроническом лимфолейкозе, болезни Вальденстрема
Появление дополнительной полосы может в присутствии фибриногена (необходимо повторное проведение электрофореза после обработки тромбином)
Заболевания, сопровождающиеся снижением уровня ЛП в сывортке крови: Ан- α -липопротеинемия (гипо- α -липопротеинемия) – врожденное нарушение синтеза апо ЛП А I и А II (у гомозиготов – вместо α -липопротеина – измененный – Тэнжи-ЛП, у гетерозиготов – нормальный и ихзмененный). При электрофорезе – вместо фракции пре- β - ЛП –широкая полоса β -ЛП А- β -липопротеинемия (гипо- β -липопротеинемия) – наследственное нарушение образования β -липопротеинов, пре- β -липопротеинов и ХМ, связанное с нарушением синтеза апо-ЛП В. В сывортке снижены уровни ХС, ФЛ, ТГ. При электрофорезе не обнаруживаются фракции β -липопротеинов и пре- β -липопротеинов
В норме β -ЛП – 38,6-69,4% Пре- β -ЛП – 4,4-23,1% α - ЛП – 22,3-53,1% добавочная фракция, соответствующая Лп(а)
Для анализа использовать свежую сыворотку, сразу поместить в холодильник, хранить не более 3 суток при 4 º Нельзя использовать замороженные образцы и применять гепарин При хранении снижается уровень ЛПОНП и повышается ЛПНП Выявление холестерина
Липопротеин (а) – липопротеинассоциированный антиген – обогащенная холестерином и белком частица, сходная с ЛПНП. Белковая часть содержит кроме Апо-100 Апо(а) –апапротеин, соединенный с ЛПНП дисульфидным мостиком Молекула ЛП(а) крупнее и имеет большую плотность, чем ЛПНП, имеет подвижность, близкую к пре- β -ЛП.
подавляет фибринолиз, способствует тромбозу N – до 140 мг/дл у мужчин, до 150 – у женщин Не зависит об возраста, пола, факторов риска (курение, гипертензия, образ жизни) При повышении > 300 мг/дл - двукратное повышение риска ИБС Измерять следует : - при подозрении на атеросклероз, особенно при повышении хсЛПНП - при оценке риска ИБС у лиц среднего возраста - при назначении ггиполипидемической терапии - при отсутсвии эффекта от статинов - для оценки риска рестенозов при ангиопластике - для оценки риска развития сердечно-сосудистых осложнений при СД Липопротеин (а)
Повышение уровня - при нефротическом синдроме - у больных на гемодиализе - при плохо контролируемом СД - при гипотиреозе - в острой стадии ИМ Понижение уровня - при гипертиреозе - у пациентов, принимающих эстрогены - при лечении неомицином
Основная форма – Hb А (две α –цепи и две – β - цепи) В незначительном количестве – Hb А 2 (две α –цепи и две – δ - цепи) и HbF (две α –цепи и две – γ - цепи) (У новорожденного 80% HbF, заменяется в течение 1 года жизни) Аномальные Hb HbS – остаток глу β - цепи заменен на вал Hb М – гис, связывающий Fe, заменен другими аминокислотами Hb С - остаток глу β - цепи заменен на лиз Другие формы
Для диагностики некоторых форм анемий у взрослых Для скрининга наследственных анемий у новорожденных Для дифференциальной диагностики анемий с другими заболеваниями (печени и др.)
Количественные, или талассемии, связанные с уменьшением или полным отсутствием синтеза α – и β -цепей ( α - талассемия и β - талассемия) Структурные или качественные, обусловлены синтезом других разновидностей Hb ( S, C, E и др.) Смешанные ( HbE - β - талассемия, HbS - β - талассемия, HbS - β - талассемия )
Кровь берут с антикоагулянтом Гемолизат готовят из отмытых физ р-ром эритроцитов добавлением гемолизирующего реактива Наибольшая подвижность – HbH, затем HbA и HbC HbS – остается в области нанесения Если HbF выше 7%, он может сливаться с гликированным Hb В кислой среде HbC смещается к аноду.
Электрофорез гемолизата нормального и содержащего HbS Электрофорез гемолизата нормального и содержащего HbC
Электрофорез гемолизата нормального содержащего около 1% HbF Электрофорез гемолизата нормального содержащего около 6 % HbF
Гликированный Hb имеет большую катодную подвижность
Ложно высокий уровень : - присутствие патологических форм Hb - при кровопотере в связи с большим содержанием молодых эритроцитов - при увеличении продолжительности жизни эритроцитов (гемолитическая анемия, полицитемии, спленэктомия)
ЛДГ ЛДГ 1 – 16-30% ЛДГ 2 – 30-40% ЛДГ 3 – 20-26% ЛДГ 4 – 6-12% ЛДГ 5 – 3-6%
Изоферменты ЛДГ сыворотки крови Изофермент Органы/ткани ЛДГ 1, ЛДГ 2 Миокард, эритроциты, почки ЛДГ 3 Селезенка, легкие, лимфоузлы, тромбоциты ЛДГ 4, ЛДГ 5 Печень, скелетные мышцы
ОИМ Соотношение ЛДГ 1 / ЛДГ 2 > 1 (в норме - < 1) Активность ЛДГ 1 возрастает не ранее суток, в 2 и более раз На долю ЛДГ 1 при обширном инфаркте приходится > 45% общей активности
Миопатия Повышается активность ЛДГ 4 и ЛДГ 5
Заболевания печени Выраженное повышение активности ЛДГ (до 10 раз) Увеличение за счет фракций ЛДГ 4 и ЛДГ 5
Использовать свежесобранные образцы сыворотки или плазмы крови. Можно использовать сыворотку, хранившуюся при t 15-30 º не более недели Нельзя замораживать Нельзя использовать гемолизированную сыворотку
При электрофорезе получают: - печеночная (L 1 )+костная (В)+плацентарная (Р) - печеночная (L 2 ) -кишечные - плацентарная Для улучшения разделения образцы обрабатывают (нейроминидаза, антисыворотки, селективные ингибиторы)
Лектин – связывает сиаловые кислоты, входящие в состав ЩФ, замедляет подвижность При проведении анализа образец наносится дважды – один проходит через лектин. Подвижность образовавшихся комплексов с лектином снижается 1, 3, 5 – без лектина, 2, 4, 6 – с лектином
Изоферменты ЩФ больного с ХПН, находяшегося на программном гемодиализе
Электрофореграмма сыворотки крови с остеопорозом, осложненным переломом
Находится в скелетных мышцах, миокарде, мозге Локализована в цитоплазме (40-45%), митохондриях (20-40%), 15-25% связана с миофибриллами, ЭР Изоферменты КК-ММ – 97-100% КК-МВ - 0-3% при активности 15-500 Е/л 0-4% при активности < 500 Е/л КК-ВВ – 0%
Схема расположения изоферментов КК
Содержание белка – 0,15-0,35 г/л 20% белков продуцируется клетками ЦНС, 80% - попадает из крови Через ГЭБ проходят в основном белки с небольшой молекулярной массой (альбумин, преальбумин, трансферрин), иммуноглобулинов – не более 3-5% СМЖ необходимо сконцентрировать При сравнении белкового спектра сыворотки крови и ликвора образцы нужно получить с интервалом не более 6 часов Сыворотку развести, чтобы концентрация белка стала одинаковой
Альбумин- основная фракция α - глобулины содержатся в небольшом количестве β -глобулины – содержат трансферрин γ -глобулины – широкая, но слабо окрашенная полоса Электрофореграмма концентрированной СМЖ и сыворотки крови
Разделение в соответствии с электрофоретической подвижностью – не пригоден для характеристики протеинурии (подвижность α 1 - микроглобулина = подвижности орозомукоида, и т.д.) Разделение в соответствии с молекулярной массой – позволяет разделить белки низкомолекулярные ( <67 кДа) – канальцевого происхождения и высокомолекулярные – ( >67 кДа) – преимущественно клубочковые Метод основан на взаимодействии белков с детергентом додецилсульфатом натрия ( SDS ). В этих комплексах все белки приобретают одну и туже конформацию и одинаковый отрицательный заряд на единицу массы. Разделение зависит только от молекулярной массы
Механизмы патологической протеинурии
Электрофорез мочи в SDS -агарозе
За сутки до 150 мг белка Четкая полоса альбумина, неразделенные фракции глобулинов
Следствие увеличения содержания низкомолекулярных белков (массивный лизис клеток) С добавлением SDS
Повреждение клубочков почки, через почечный барьер проходят белки с Мм > 67 кДа
Развивается при изменении заряда на гломерулярной мембране Проходят белки средние белки – альбумин и трансферрин С добавлением SDS
Увеличены размеры пор в мембране В мочу проходят белки с Мм до 100 кДа Электрофореграмма мочи сходна с электрофореграммой сыворотки крови
Патологические измения в канальцах Нарушена реабсорбция белков из первичной мочи Выводятся белки с Мм менее 40 кДа Доля альбумина < 40%
Появляются белки, характерные как для клубочковой, так и для канальцевой формы
Попадают в мочу из мочевого пузыря и уретры Похожа на гломерулярную протеинурию Дифференцировать по белкам с высокой молекулярной массой (- α 2 - макроглобулин отсутствует при гломерулярной, но появляется при постренальной протеинурии)
Иммунофиксация – качественный метод, позволяющий установить природу моноклонального компонента Методы определения – гелевый электрофорез на агарозе и капиллярный (иммунозамещение) Дополнительные полосы, которые обнаруживаются в гамма зонах, могут соответствовать моноклональным белкам, что указывает на наличие гаммапатий. В основе идентификации лежит реакция образования комплекса антиген-антитело, при добавлении к сыворотке пациента моноспецифических антител к IgG, IgM, IgA, и -легким цепям. Иммунофиксация
Выявление моноклональных гаммапатий Иммунофиксация в гелевом электрофорезе На агарозном геле разделение белков IFE в сыворотке происходит в соответствии с их зарядом. Затем белки инкубируют с моноклональными антисыворотками, промывают и окрашивают, проявившиеся иммунопреципитаты качественно интерпретируют. Выделение и выявление моноклональных гаммапатий методом гелевого электрофореза. IT
IT 1. Антисыворотка добавляется непосредственно к пробе. Если есть антитела, то происходит образование комплекса Антиген-Антитело. 2. Антисыворотка передвигается по капилляру к катоду в соответствии с зарядом. Электрофоретическая подвижность комплекса Антиген-Антитело, значительно ниже. Комплекс антисыворотка-антитело детектируется при прохождении от анода к катоду. Моноклоны удаляются (замещаются) из электрофореграммы. Иммунотипирование в капиллярном электрофорезе Выявление моноклональных гаммапатий 3. Катод - Иммунотипирование в капиллярном электрофорезе Выявление моноклональных гаммапатий
IgG IgA IgM lambda Оригинальная электрофореграмма белка сыворотки kappa IT Можно сделать следующий вывод : IgG kappa При иммунотипировании происходит наложение электрофореграммы с добавлением антисыворотки на электрофореграмму без добавления антисыворотки. При наложении электрофореграмм, после добавления трех антисывороток, происходит почти полное совпадение контура без исчезновения пика в области гамма-зоны. Из-за удаления (замещения) гамма глобулинов в течении проведения капиллярного электрофореза два наложения на оригинальную электрофореграмму будут показывать исчезновение пика из области гамма-зоны, те комплекс Аг-Ат будет перемещен в другую не видимую нами зону. Выявление моноклональных гаммапатий Иммунотипирование в капиллярном электрофорезе
спасибо за внимание
Определение фракций белков в моче должно проводиться после концентрирования и обессоливания образца Метод валидирован проф. Mussap, Genoa ITALY. Чувствительность центрифужного метода 20mg/L Чувствительность колоночного метода 20mg/L
Negative Positive
