Лабораторная работа №7 по «Генетике прокариот» Министерство образования и науки Российской Федерации Федеральное бюджетное государственное образовательное учреждение высшего образования « Оренбургский государственный университет» Химико-биологический факультет Кафедра биохимии и микробиологии Давыдова Ольга Константиновна, к.б.н., доцент
Параметры выделения ДНК Выделение ДНК из бактериальных клеток Фенольный метод Щелочной метод Выделение с использованием сорбентов Выделение на микроколонках
а) чистотой конечного продукта б) временем, необходимым для его получения в) применимостью для выделения больших (или, напротив, небольших) количеств продукта
Выход из культур, находящихся в стационарной фазе часто оказывается ниже, чем из культур в логарифмической фазе
1) с помощью одного лишь детергента 2) с использованием сочетания действия детергентов и гидролитических ферментов или 3) с помощью физических методов, таких как разрушение под действием ультразвука, в результате резкого изменения давления или при встряхивании со стеклянными шариками
После лизиса клеточного материала образуется мультикомпонентная смесь, содержащая, в том числе, ДНК. В связи требуется очистка целевой ДНК: 1) Очистка раствора с помощью методов органической экстракции (с помощью фенола, хлороформа) с последующим осаждением ДНК спиртами и растворением в воде 2) Дифференциальная сорбция ДНК на твердом носителе (чаще всего силикагели с повышенным отрицательным зарядом или модифицированной поверхностью), после нескольких стадий отмывки сорбента с локализованной на его поверхности ДНК органическими растворителями ДНК смывается водой
Белки экстрагируют смесью фенола, хлороформа, изоамилового спирта. Поскольку плотности этих органических растворитлей отличны от плотности воды, при центрифугировании лизата клеток, к которому были добавлены фенол и хлороформ, образуется два отдельных слоя: нижний, представляющий собой раствор на основе органических растворителей, и верхний, содержащий водный раствор. При этом белки денатурируют и образуют преципитат, который располагается узкой полосой на границе водной и органической фаз. Если фенол был уравновешени буфером с нейтральным значением рН, то водная фаза будет содержать сразу и ДНК, и РНК. Если же фенол был уравновешен буфером, имеющим кислое значение рН, то ДНК окажется в нижнем, органическом слое, а РНК - в верхнем, водном. Далее используют осаждение ДНК этанолом (изопропанолом).
В ходе эксперимента изменяют pH раствора, содержащего геномную и плазмидную ДНК, на щелочной. При таком значении pH вся ДНК денатурирует. Однако цепи двуцепочечной плазмидной ДНК при этом остаются связанными друг с другом, поскольку плазмиды имеют кольцевую форму. При дальнейшей ренатурации, которая инициируется изменением pH раствора до первоначального, длинные цепи геномной ДНК, успев разойтись в растворе при денатурации, образуют плотный неструктурированный комок, а цепи плазмидной ДНК успешно восстанавливают исходную структуру. Теперь плазмидную ДНК легко отделить от геномной ДНК в ходе центрифугирования.
Экстракция ДНК в домашних условиях http://www.examen.ru/add/School-Subjects/Natural-Sciences/Genetics/7672/7694 Лаборатория в домашних условиях http://www.vokrugsveta.ru/vs/article/7872/ Биохакинг http://theoryandpractice.ru/posts/7618-biokhacking
